劉金，黃毅，孫艷波，顏亨梅,*

1. 北京師范大學(xué)珠海分校不動(dòng)產(chǎn)學(xué)院，珠海 519087 2. 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410081

水稻是我國乃至全世界的主要糧食作物，水稻生產(chǎn)在保障基本營(yíng)養(yǎng)供給和糧食安全方面，意義非常重大，其安全性尤為重要。與傳統(tǒng)育種方法不同的是，轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)是應(yīng)用生物技術(shù)手段打破了物種生殖隔離屏障，將一種(類)生物的某一目的基因片段引入到另一種(類)生物基因組中改變其遺傳性狀以獲得人們期望的優(yōu)良性狀，使動(dòng)物、植物、微生物之間可以實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)交流。為了防止在基因操作過程中，把一些可能對(duì)人體健康或?qū)Νh(huán)境安全有害的個(gè)別基因轉(zhuǎn)入受體生物，或者由于基因操作引起受體生物產(chǎn)生某些不可預(yù)期的變化，影響動(dòng)物、人體健康和環(huán)境安全，世界各國政府都對(duì)轉(zhuǎn)基因生物的安全性高度重視，并積極加以評(píng)估。

轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)人類健康是否產(chǎn)生危害，對(duì)機(jī)體細(xì)胞、組織和器官等是否具有毒性及損害，一直以來爭(zhēng)議不斷，日趨激烈，近幾年來在全世界引起了普遍的關(guān)注[1-4]。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積不斷擴(kuò)大和我國對(duì)轉(zhuǎn)基因糧食的需求量不斷增加，對(duì)其進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)具有重大的意義[5-7]。

目前國內(nèi)外對(duì)轉(zhuǎn)基因稻谷所做安全性評(píng)價(jià)研究不少，但主要集中在傳統(tǒng)毒理學(xué)方法(動(dòng)物試驗(yàn))方面，一般采用代謝產(chǎn)物分析[8]、毒代動(dòng)力學(xué)[9-10]、慢性毒性及亞慢性毒性[11-12]、繁殖試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)等[13-14]方法，其安全性評(píng)價(jià)方法主要通過飼喂模型動(dòng)物來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因稻谷對(duì)動(dòng)物靶器官潛在的影響[2,14-15]。整個(gè)試驗(yàn)過程耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，費(fèi)用高；傳統(tǒng)毒理學(xué)方法檢測(cè)層面仍停留在組織、器官病理性改變層面，并未涉及細(xì)胞層面。本研究采用CCK-8試驗(yàn)(Cell Counting Kit-8 Assay)和中性紅試驗(yàn)(Neutral Red Uptake assay, NRU)來檢測(cè)轉(zhuǎn)基因稻米全蛋白成分對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的損傷程度(毒性大小)，耗時(shí)短，工作量較小，費(fèi)用較低，能夠在細(xì)胞水平上檢測(cè)毒性大小，對(duì)轉(zhuǎn)基因大米的細(xì)胞毒性進(jìn)行客觀、科學(xué)的評(píng)價(jià)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)基因大米(Bar68-1)及對(duì)照組非轉(zhuǎn)基因親本大米D68(由中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所鑒定提供)。試驗(yàn)以小鼠淋巴細(xì)胞系為靶細(xì)胞，該細(xì)胞系取自昆明小鼠(Musmusculus)脾臟，由湖南師大生科院心臟發(fā)育實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試 劑

苯甲基磺酰氟(PMSF)(美國Amresco公司)，Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，長(zhǎng)春新堿(美國Amresco公司)，胎牛血清(美國Hyclone公司)，中性紅染料(上海三愛思試劑有限公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(將NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、Na2HPO41.56 g、KH2PO40.20 g定容至1 L，室溫儲(chǔ)存，高壓消毒后使用)，中性紅儲(chǔ)備液(將中性紅10.0 g加入去離子水至100 mL，在37 ℃溫度下放置30 min后搖勻，室溫保存，臨用時(shí)用去離子水稀釋40倍后即可)，中性紅萃取液(水4.9 mL+乙醇5.0 mL+冰乙酸100 μL充分混勻后配制，現(xiàn)配現(xiàn)用)。

1.3 儀器設(shè)備

全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(TECAN Safire2，法國)，恒溫振蕩器(上海精宏公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(GH5000B，美國Forma公司)，生化培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.4 方 法

1.4.1 大米全蛋白的制備

分別取新鮮Bar68-1大米和D68大米約10 g，加入液氮后用研缽充分研磨成粉末。融解Western及IP細(xì)胞裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前的幾分鐘加入苯甲基磺酰氟(美國Amresco公司)，使PMSF的最終濃度為1 mmol·L-1。稱取50 mg樣品，按照每20 mg組織加入100～200 μL裂解液的比例加入Western及IP細(xì)胞裂解液(碧云天)。充分裂解后，以10 000～14 000 g離心3～5 min，取上清液。將上清液放入密理博Microcon Ultra-0.5 3 000超濾管，再放入1.5 mL離心管以14 000 g離心，棄離心管里濾液，往超濾管中加入450 μL、4 ℃預(yù)冷的1×磷酸鹽緩沖液(PBS)。以14 000 g離心，棄離心管里濾液，此步驟重復(fù)1次。以1.5 mL新離心管替換，倒置超濾管，以1 000 g的速度離心，收集蛋白。將提取的轉(zhuǎn)基因大米全蛋白溶解于磷酸鹽緩沖液(PBS)中，利用超聲波震蕩以充分混勻。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天)測(cè)定大米全蛋白的濃度，并調(diào)節(jié)濃度為1 mg·mL-1，將原液置于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組

將1 mL小鼠淋巴細(xì)胞懸浮液(密度為50 000個(gè)·mL-1)加入24孔培養(yǎng)板中，在37 ℃下培養(yǎng)細(xì)胞。Bar68-1大米和D68大米全蛋白的暴露濃度分別設(shè)定為25、50、100和200 μg·mL-1，各濃度暴露時(shí)間分別為2 h、6 h、24 h。磷酸鹽緩沖液(PBS)作為空白劑陰性對(duì)照，長(zhǎng)春新堿(美國Amresco公司)作為CCK-8試驗(yàn)、中性紅攝取試驗(yàn)的陽性對(duì)照。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 細(xì)胞活性檢測(cè)

1.4.3.1 CCK-8試驗(yàn)

參考Jiang等[16]的方法，按照CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)上面的步驟進(jìn)行試驗(yàn)。使用分光光度計(jì)(TECAN，法國)450 nm波長(zhǎng)測(cè)量并記錄結(jié)果，以測(cè)定細(xì)胞中脫氫酶(催化物質(zhì)氧化還原反應(yīng)的酶)活性表示細(xì)胞活性。

1.4.3.2 中性紅攝取(NRU)試驗(yàn)

根據(jù)Putnam等[17]和Canal-Raffin等[18]的操作步驟并加以改進(jìn)，在暗室黃光下完成試驗(yàn)。最后參考Geh等[19]方法，用分光光度計(jì)(TECAN，法國)于540 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣品并記錄結(jié)果，以測(cè)定溶酶體攝入中性紅的量來表示細(xì)胞活性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)包處理。數(shù)據(jù)用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或單因素方差分析(ANOVA)，如果方差齊，使用最小顯著法(LSD)兩兩之間比較；如果方差不齊，就應(yīng)用Dunnett’s T3進(jìn)行兩兩比較。當(dāng)p<0.05時(shí)，表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 CCK-8試驗(yàn)

在3個(gè)孵育時(shí)間段后，長(zhǎng)春新堿組的小鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)，所測(cè)得的淋巴細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組的淋巴細(xì)胞(p<0.05，見表1)。淋巴細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)春新堿(0.025 μg·mL-1)分別孵育2 h、6 h和24 h后，測(cè)得細(xì)胞存活率分別為79.45±1.21、73.92±0.94和59.53±1.13，損傷作用與時(shí)間存在一定的效應(yīng)關(guān)系。如轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1組與非轉(zhuǎn)基因大米D68組體外CCK-8試驗(yàn)結(jié)果所示(見圖1)，淋巴細(xì)胞與轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白共同孵育后的存活率和與非轉(zhuǎn)基因大米D68共同孵育后的存活率相比較，無顯著差異(p>0.05)；與空白對(duì)照組存活率比較，差異不顯著(p>0.05)。

2.2 中性紅攝取試驗(yàn)

在3個(gè)孵育時(shí)間段后，長(zhǎng)春新堿組的小鼠淋巴細(xì)胞經(jīng)中性紅攝取試驗(yàn)檢測(cè)，所測(cè)得的淋巴細(xì)胞存活率顯著低于空白對(duì)照組的淋巴細(xì)胞(p<0.05，見表2)。淋巴細(xì)胞經(jīng)長(zhǎng)春新堿(0.025 μg·mL-1)分別孵育2 h、6 h和24 h后，測(cè)得細(xì)胞存活率分別為81.26±1.35、74.85±1.16和60.51±1.27，損傷作用與時(shí)間存在著明顯的效應(yīng)關(guān)系。轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白組與非轉(zhuǎn)基因大米D68全蛋白組體外中性紅試驗(yàn)結(jié)果顯示(見圖2)，轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白孵育的淋巴細(xì)胞存活率和與非轉(zhuǎn)基因大米D68孵育的相比，不存在顯著性差異(p>0.05)；與空白對(duì)照組存活率比較，差異不顯著(p>0.05)。

圖1 CCK-8試驗(yàn)細(xì)胞存活率比較注：圖中C0表示空白對(duì)照組，Z25、Z50、Z100和Z200分別表示25、50、100和200 μg·mL-1轉(zhuǎn)基因大米全蛋白組，C25、C50、C100和C200分別表示25、50、100和200 μg·mL-1非轉(zhuǎn)基因大米全蛋白組,(下同)。Fig. 1 Comparison of survival rate of lymphocytes detected by CCK-8 assayNote: C0: Blank control; Z25、Z50、Z100和Z200 represented 25, 50, 100 and 200 μg·mL-1 of whole proteins of GM rice, respectively; C25、C50、C100和C200 represented 25, 50, 100 and 200 μg·mL-1 of whole proteins of non-GM rice, respectively.

表1 體外CCK-8試驗(yàn)淋巴細(xì)胞存活率(平均值±SD)Table 1 The survival rate of lymphocytes detected by CCK-8 assay in vitro (Mean±SD) (%)

注：﹡表示與空白對(duì)照組比較，p<0.05。

Note:﹡Compared with blank control group,p<0.05.

表2 體外中性紅攝取試驗(yàn)淋巴細(xì)胞存活率(平均值±SD)Table 2 The survival rate of lymphocytes detected by neutral red uptake (NRU) assay in vitro (Mean±SD) (%)

注：﹡表示與空白對(duì)照組比較，p<0.05。

Note:﹡Compared with blank control group,p<0.05.

圖2 中性紅試驗(yàn)細(xì)胞存活率比較Fig. 2 Comparison of survival rate of lymphocytes detected by red uptake (NRU) assay

3 討論(Discussion)

CCK-8試驗(yàn)、中性紅攝取試驗(yàn)同屬細(xì)胞毒性檢測(cè)試驗(yàn)，但兩者的檢測(cè)機(jī)理不同：CCK-8試驗(yàn)主要通過評(píng)價(jià)細(xì)胞內(nèi)脫氫酶的活力來檢測(cè)細(xì)胞的存活率，中性紅試驗(yàn)通過測(cè)量溶酶體攝入染料的量來反映細(xì)胞的存活率。兩者有機(jī)結(jié)合，可有效提高檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度。本研究在細(xì)胞毒性檢測(cè)方面選取兩種不同檢測(cè)機(jī)理的試驗(yàn)，其目的在于提高試驗(yàn)的客觀準(zhǔn)確性。按照毒理學(xué)試驗(yàn)的要求，本試驗(yàn)暴露時(shí)間設(shè)定為2 h、6 h和24 h，便于從短期內(nèi)觀測(cè)細(xì)胞存活率是否存在著明顯的損傷作用-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系，以探討細(xì)胞毒性大小與暴露時(shí)間之間的關(guān)系。

CCK-8試驗(yàn)和中性紅試驗(yàn)中陽性對(duì)照組小鼠淋巴細(xì)胞在3個(gè)不同孵育時(shí)間段后存活率與空白組相比，存在顯著差異(p<0.05)。其中，CCK-8試驗(yàn)、中性紅試驗(yàn)測(cè)得細(xì)胞存活率存在著明顯的損傷作用-時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。說明CCK-8試驗(yàn)與中性紅試驗(yàn)?zāi)苡行z出長(zhǎng)春新堿(Vincristine, VCR)導(dǎo)致的細(xì)胞死亡效應(yīng)，方法敏感有效。轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白組與非轉(zhuǎn)基因大米D68全蛋白組體外試驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白一起孵育后的淋巴細(xì)胞存活率與被非轉(zhuǎn)基因大米D68全蛋白孵育后的細(xì)胞存活率相比較，無顯著性差異(p>0.05)；與空白對(duì)照組細(xì)胞存活率的差異也不顯著(p>0.05)。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞無明顯急性細(xì)胞毒性，與非轉(zhuǎn)基因大米D68全蛋白等同。這與陳吳建等[20]對(duì)轉(zhuǎn)基因大米Bt63的安全性評(píng)價(jià)結(jié)果一致，轉(zhuǎn)基因大米Bt63對(duì)人淋巴細(xì)胞無明顯細(xì)胞毒性。

本研究應(yīng)用了急性毒性試驗(yàn)方法，以多個(gè)劑量全蛋白分別孵育小鼠淋巴細(xì)胞2 h、6 h和24 h，在短期(24 h)內(nèi)了解轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白的毒性大小和特點(diǎn)，所以，試驗(yàn)結(jié)果只能證明轉(zhuǎn)Bar基因稻谷全蛋白沒有短期試驗(yàn)中的細(xì)胞毒性。至于轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞是否具有亞慢性或慢性細(xì)胞毒性，還有待于進(jìn)一步研究。

轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷的外源基因——Bar基因的表達(dá)產(chǎn)物為膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(phosphinthricin acetyl transferase, PAT)，PAT作為Bar基因的表達(dá)產(chǎn)物和稻谷的外源成分，在轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷中具有一定的含量。研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因大米Bar68-1全蛋白對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞無急性細(xì)胞毒性，作者認(rèn)為，可能存在兩種原因：(1)PAT本身對(duì)有機(jī)體無急性毒性，安全可靠；(2)轉(zhuǎn)Bar基因稻谷中的PAT含量太低，不足以產(chǎn)生明顯的急性毒性效應(yīng)。具體情況還有待于進(jìn)一步研究。

致謝：感謝中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所唐香山博士和湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生廖四芳等同學(xué)的幫助。

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