張勁松, 王昌留, 張?jiān)聢A, 張曉燕

(1. 魯東大學(xué) 教育科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025; 2. 魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025)

文昌魚實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)與繁殖

Breeding and reproduction of amphioxus in laboratory

張勁松1, 王昌留2, 張?jiān)聢A2, 張曉燕2

(1. 魯東大學(xué) 教育科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025; 2. 魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 山東 煙臺(tái) 264025)

文昌魚(amphioxas或 lancelet)屬于脊索動(dòng)物門(Chordata)、頭索動(dòng)物亞門(Subphylum Cephalochordata)、文昌魚綱(Amphioxi)、文昌魚目(Amphioxiforms)、文昌魚科(Amphioxidae), 有2屬或3屬(有爭(zhēng)議), 它們是鰓口文昌魚屬(Branchiostoma), 側(cè)殖文昌魚屬(Epigonichthys), 偏文昌魚屬(Asymmetron)。早在5.2億年前就已經(jīng)出現(xiàn), 是無(wú)脊椎動(dòng)物進(jìn)化到脊椎動(dòng)物的過(guò)渡類型, 也是脊椎動(dòng)物的祖先原型。因其具有個(gè)體小、產(chǎn)卵量大、體外受精和發(fā)育以及胚胎透明便于觀察等作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的優(yōu)點(diǎn)[1], 特別是現(xiàn)在的文昌魚基因組大約只是脊椎動(dòng)物基因組的 17%[2-3],且脊椎動(dòng)物(包括人)中絕大多數(shù)基因和基因家族均可在文昌魚中找到高度同源的祖先型成員, 反映了脊椎動(dòng)物祖先的基因組特征, 被認(rèn)為是研究脊椎動(dòng)物起源和進(jìn)化的模式動(dòng)物[4-5]。但是近年來(lái)由于環(huán)境污染、過(guò)度捕撈等原因, 使文昌魚的生存環(huán)境受到嚴(yán)重破壞, 其數(shù)量在世界各分布區(qū)均呈下降趨勢(shì)。為了保護(hù)文昌魚這種珍稀資源, 中國(guó)先后在河北昌黎、山東青島和福建廈門建立了國(guó)家和地方文昌魚自然保護(hù)區(qū), 以期遏制文昌魚資源衰減的趨勢(shì)[6]。有關(guān)文昌魚繁殖生物學(xué)及人工養(yǎng)殖研究可追溯到1937年, 童第周等[7-8]率先在中國(guó)突破了文昌魚室內(nèi)繁殖技術(shù),并于1952年通過(guò)人工受精獲得正常發(fā)育的卵子。后來(lái), 國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者陸續(xù)開展了文昌魚的實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)與繁殖方面的研究工作: Zhang等[9-10]將野外海區(qū)采集的文昌魚飼養(yǎng)了 la以上并正常產(chǎn)卵與排精; Yasui 等[11]通過(guò)構(gòu)建循環(huán)水培育系統(tǒng)完成了日本文昌魚的室內(nèi)飼養(yǎng)與繁殖, 并培育出子代文昌魚; Wu等[12-13]曾報(bào)道過(guò)實(shí)驗(yàn)室成功繁殖文昌魚子一代, 并在戶外容器中飼養(yǎng)達(dá)2 a以上; 王義權(quán)等[14]獲得了文昌魚的子二代, 初步實(shí)現(xiàn)了文昌魚在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的全人工養(yǎng)殖。作者就文昌魚種類、分布與生活習(xí)性、飼養(yǎng)與繁殖等方面的研究成果進(jìn)行綜述, 為進(jìn)一步加強(qiáng)文昌魚人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)的探索, 特別是為文昌魚資源的恢復(fù)和開發(fā)利用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 種類、分布與生活習(xí)性

公元 819年唐朝韓愈在潮州作刺史時(shí), 因鱷魚作惡, 殺鱷魚時(shí)發(fā)現(xiàn)了文昌魚, 由于這一發(fā)現(xiàn)沒有鑒定、描述、定名、發(fā)表, 未被世界公認(rèn)[15]?，F(xiàn)認(rèn)為首次對(duì)文昌魚進(jìn)行研究報(bào)道的是德國(guó)動(dòng)物學(xué)家Pallas 1774年在英格蘭南部發(fā)現(xiàn)了文昌魚, 因其外形類似蛞蝓, 誤認(rèn)為是軟體動(dòng)物, 遂將這種文昌魚定名為L(zhǎng)imax lanceolatus。1834年意大利動(dòng)物學(xué)家Costa改名為Branchistomalubricum, 1836年Yarrel將文昌魚更名為Branchiostoma lanceolatum—直沿用至今[16-17]。據(jù) Poss等報(bào)道, 世界上現(xiàn)存的文昌魚有29種[18], 現(xiàn)認(rèn)為大約31種[19-20], 分布于南緯40o至北緯48o之間的廣大海域, 包括大西洋、印度洋、太平洋沿岸的熱帶、亞熱帶、溫帶地區(qū)以及一些島嶼的周圍海域[18,21-22]。迄今, 全世界已報(bào)道產(chǎn)文昌魚的國(guó)家有: 英國(guó)、法國(guó)、德國(guó)、俄羅斯、意大利、尼日利亞、美國(guó)、以色列、墨西哥、日本、新西蘭、澳大利亞、新加坡、斯里蘭卡、印度和中國(guó)等[23-25]。在中國(guó), 文昌魚的分布十分廣泛, 只要有適合文昌魚棲息的沙灘, 均有文昌魚分布的可能, 從南到北,包括海南、廣西(合浦、北部灣)、廣東(遂溪、汕頭、南澳)、臺(tái)灣(金門、馬祖、南灣和基隆)、福建閩江口以南大部分海域、山東(青島、威海、煙臺(tái)、萊州灣)及河北秦皇島等都發(fā)現(xiàn)了文昌魚[19-20,26]。文昌魚對(duì)生態(tài)環(huán)境的要求較高, 既要有適合其生命活動(dòng)的底質(zhì)環(huán)境和生物餌料, 又要有清潔的環(huán)境條件。大多數(shù)生活在水流較為平緩, 水深為8～16 m, 水溫12～30℃, 鹽度21～30, pH值8.09～8.18, 具有中細(xì)沙混合的底質(zhì),水質(zhì)清新, 浮游生物豐富的海域中[22,27]。文昌魚雖可游泳, 但大部分時(shí)間身體埋于水底的砂礫或泥中,僅露出頭部, 但夜間較為活躍, 憑借肌節(jié)的交錯(cuò)收縮, 在海水中作短暫的停留。覓食時(shí), 將身體前部伸出砂礫表面以濾食流過(guò)鰓裂的硅藻等食物顆粒[28]。

2 飼養(yǎng)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 目前有關(guān)文昌魚飼養(yǎng)和繁殖研究較多的有白氏文昌魚(Branchiostomabelcheri)、青島文昌魚(B. belcheri tsingtauense現(xiàn)有人稱B. japonicum, 有爭(zhēng)議, 作者沿用前者)、歐洲文昌魚(B.lanceolatum)、佛羅里達(dá)文昌魚(B . floridae), 但馬來(lái)文昌魚(B. malayanum)[29]、尼日利亞文昌魚(B.nigeriense)[30]、塞內(nèi)加爾文昌魚(B. senegalense)[31]、魯卡偏文昌魚(Asymmetron lucayanum)[32-33]也有少量報(bào)道。

2.1 養(yǎng)殖條件

Chin[34]最早闡述了如何在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)文昌魚,他用方形的標(biāo)本缸(15 cm×15 cm×25 cm)缸底鋪設(shè)沙層 7 cm左右, 每缸飼養(yǎng)健康個(gè)體5～10尾, 海水pH控制在8.4左右、溫度12～30℃、鹽度19～29, 以浮游硅藻作為餌料, 在實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)活文昌魚達(dá) 8個(gè)月之久。文昌魚的飼養(yǎng)必須考慮容器、沙粒、鹽度、餌料、pH值、光照、溫度、溶氧量及飼養(yǎng)密度等諸多問(wèn)題。容器的質(zhì)地、大小和形狀對(duì)對(duì)文昌魚的飼養(yǎng)影響不大, 玻璃缸[34-35]、水泥池[36]、泥缸[37]、塑料缸(箱)[9,38]均可。文昌魚對(duì)沙粒直徑的要求較高, 一般在 0.5～1 mm, 沙粒太小會(huì)阻礙其呼吸[27], 但對(duì)沙層厚度要求不高, 只要埋沒身體即可, 一般5～15 cm。沙粒最好選自文昌魚生活的海區(qū), 用前先經(jīng)金屬網(wǎng)篩(1 mm網(wǎng)格)篩過(guò), 再用淡水浸泡2 d, 最后用新鮮海水徹底浸洗 2次, 曬干備用。也有用河沙經(jīng)粗篩, 選粒徑與海沙相仿部分, 用漂白粉消毒并洗凈后曬干,使用前以人工海水浸泡 2 d的成功報(bào)道[39]。近來(lái)Fuentes 等[40]用方形塑料桶無(wú)沙飼養(yǎng)歐洲文昌魚(Branchiostoma lanceolatum)使其成功產(chǎn)卵, Yasui 等[11]借鑒斑馬魚室內(nèi)循環(huán)水培育系統(tǒng)無(wú)沙飼養(yǎng)產(chǎn)于日本的白氏文昌魚(Branchiostoma belcheri), 并成功繁育出子代。文昌魚對(duì)海水鹽度的忍受力較強(qiáng), 在25～33范圍內(nèi)都可以正常生活, 沙層上面海水深度 20 cm左右, 產(chǎn)卵季節(jié)為便于捕獲游離于水面的文昌魚可適當(dāng)增加海水的深度。內(nèi)陸實(shí)驗(yàn)室人工海水(鹽度29～31)飼養(yǎng)的文昌魚其成活率、平均體質(zhì)量及平均性腺直徑均與天然海水的無(wú)顯著差異[39]。文昌魚主要以單胞藻為食, 常用餌料綜合起來(lái)有金藻門的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangensis)、綠色巴夫藻(Pavlova viridis), 硅藻門的牟氏角毛藻(Chaetoceros muelleri)、鈣質(zhì)角毛藻(Chaetoceros calcutrans)、三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutm)、纖細(xì)角毛藻(chaetoceros gracilis)、Chaetoceros calcitorance, 綠藻門的青島大扁藻(Platymonas helgolandicavar. tsingtaoensis)、小球藻(Chlorella)、扁藻(Tetraselmis)、鹽藻(Dunaliella salina)、杜氏鹽藻(Dunaliella tertiolecta)、四鞭片藻(Tet-raselmis suecica), 黃藻門的異膠藻(Heterogroea)、后棘藻(Ellipsoidion)及藍(lán)藻門的螺旋藻(Spirulina)等。

2.2 親魚的飼養(yǎng)與管理

文昌魚飼養(yǎng)密度取決于其個(gè)體大小及沙層表面積, 一般每平米飼養(yǎng)成體 2000～3000 尾[22], 連續(xù)充氣, 自然光照和室溫飼養(yǎng)(水溫控制于 15～28℃), 每天早晚投喂單細(xì)胞藻各 1 次, 投餌前更換約 2/3海水, 新鮮海水需經(jīng)事先過(guò)濾, 投餌量視文昌魚個(gè)體數(shù)量而定, 單胞藻種類可以是單一種類或幾種不同藻類的混合液, 一般投喂后3 h左右海水略顯渾濁為宜。飼養(yǎng)期間要及時(shí)去除附著于養(yǎng)殖缸(箱)壁的藻類、沙層表面的文昌魚糞便及受刺激不能鉆沙的不健康文昌魚, 每隔30～40 d定期全部更換沙層, 以保持沙層整體的清潔。

3 繁殖

文昌魚絕大多數(shù)為雌雄異體, 目前發(fā)現(xiàn)雌雄同體報(bào)道的只有歐洲文昌魚[41-42]、白氏文昌魚[34,43]的極少數(shù)個(gè)體, 但未見無(wú)性生殖的文獻(xiàn)。大多數(shù)文昌魚一生可以多次繁殖, 僅尼日利亞拉各斯礁湖的繁殖過(guò)后就死亡[30]。

3.1 親魚的排精與產(chǎn)卵

研究天然文昌魚的繁殖季節(jié)難度很大, 一般是根據(jù)不同時(shí)期采集的大量標(biāo)本依靠性腺發(fā)育、幼體的數(shù)量及發(fā)育狀態(tài)等進(jìn)行估算。一般認(rèn)為不同種或同種不同地理種群的文昌魚繁殖季節(jié)有差異, 北半球的文昌魚在5～6月產(chǎn)卵, 南半球的在11～12月產(chǎn)卵, 而熱帶地區(qū)的文昌魚一年有2次或多次產(chǎn)卵[44]。研究室內(nèi)文昌魚的繁殖時(shí)間比較容易, 童第周等 1937年在實(shí)驗(yàn)室就成功獲得青島文昌魚所產(chǎn)卵子, 20世紀(jì)50年代徹底解決了其室內(nèi)繁殖技術(shù)[7], 金德祥1964年以白氏文昌魚為材料也在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)得到所產(chǎn)卵子[45]。至此有關(guān)文昌魚繁殖生物學(xué)的報(bào)道開始增多, Wu等[12]和張士璀等[10]觀察到青島文昌魚先是雄性個(gè)體游出水面排精, 而后雌性個(gè)體排卵, 整個(gè)繁殖季節(jié)可從6月下旬持續(xù)到8月初, 中間有幾天休產(chǎn)期。Kubokawa等[46]用紅外攝像觀察了繁殖季節(jié)產(chǎn)于日本的白氏文昌魚夜間的游泳行為, 發(fā)現(xiàn)文昌魚每次產(chǎn)卵都首先是雄性從沙層躍出, 然后在近水面處排精, 接下來(lái)雌雄產(chǎn)卵、排精沒有固定的順序, 排精、產(chǎn)卵大多集中在第一尾雄性文昌魚排精開始后的 90 min內(nèi)。方永強(qiáng)等[47]詳細(xì)觀察白氏雌、雄文昌魚的產(chǎn)卵和排精行為: 首先是個(gè)別雄魚先躍出水面沿著缸旁急速游動(dòng)后鉆入沙中, 后有雌魚出現(xiàn), 雌雄文昌魚從水缸底層的不同部位躍出, 同時(shí)見多尾雌雄魚互相追逐、轉(zhuǎn)圈、波浪式快速游泳, 從18:45開始產(chǎn)卵和排精到結(jié)束可持續(xù)4 h多。Stokes等[48]觀察了從1991年初夏到1995年夏末在外海采集到的21 000余尾佛羅里達(dá)文昌魚的生殖習(xí)性, 在繁殖季節(jié)(春末至夏末), 文昌魚群體在日落后產(chǎn)卵, 在某一既定日期產(chǎn)卵文昌魚的比例占成年群體的一小部分至絕大部分(約 90%), 雄性個(gè)體和雌性可在繁殖季節(jié)中短短的 1～2周再次成熟和排放精卵。Fuentes等[40]也證實(shí)分布于法國(guó)和西班牙邊界的歐洲文昌魚在5月底自然產(chǎn)卵, 6月底還可以再次產(chǎn)卵。最近, Theodosiou等[49]用人工海水飼養(yǎng)歐洲文昌魚使其順利產(chǎn)卵并進(jìn)行了精子冷凍保存的研究, Holland等[32-33]以魯卡偏文昌魚(Asymmetron lucayanum)為材料在27℃通過(guò)室內(nèi)光照和黑暗處理可改變其傳統(tǒng)的產(chǎn)卵季節(jié)。這些成果預(yù)示一旦人們?nèi)嬲莆瘴牟~的飼養(yǎng)技術(shù), 人為控制文昌魚的產(chǎn)卵季節(jié), 實(shí)現(xiàn)文昌魚的一年多次產(chǎn)卵及建立“干”實(shí)驗(yàn)室(內(nèi)陸實(shí)驗(yàn)室)養(yǎng)殖技術(shù)等是完全可行的[14]。

3.2 影響文昌魚繁殖的環(huán)境因素

文昌魚生活在淺水海灘, 其繁殖具有明顯的季節(jié)性, 溫度、光照、海水鹽度、pH 值、潮汐變化等對(duì)其生殖細(xì)胞的發(fā)生都會(huì)產(chǎn)生影響[50]。室內(nèi)文昌魚人工飼養(yǎng)與繁殖成功的前提條件主要取決于 2個(gè)因素: 一是充足的餌料, 以保證文昌魚能正常生長(zhǎng)發(fā)育, 使性腺發(fā)育成熟; 二是保持室內(nèi)文昌魚棲息環(huán)境的清潔, 因?yàn)槭覂?nèi)飼養(yǎng)容器體積小, 缺乏海區(qū)的自凈化能力, 文昌魚產(chǎn)生的糞便及食物殘?jiān)姆e累會(huì)嚴(yán)重影響文昌魚的生存[51]。迄今, 許多學(xué)者進(jìn)行了有關(guān)文昌魚室內(nèi)繁殖生物學(xué)的研究, 對(duì)其影響因素已得到較為滿意的結(jié)果。

3.2.1 溫度

溫度是影響文昌魚繁殖的主要環(huán)境因素, 性腺的發(fā)育、成熟及產(chǎn)卵、排精的發(fā)生都與水溫密切相關(guān)[52-53]。在天然海區(qū), 冬季水溫較低(15℃), 方永強(qiáng)等[54]發(fā)現(xiàn)該水溫有利于白氏文昌魚早期精巢的發(fā)育,而對(duì)卵巢則無(wú)明顯的影響; 水溫在 23～25℃可能是其性腺發(fā)育和成熟的較適溫度, 高于 28℃對(duì)性腺發(fā)育不利。王嫣等[39]也發(fā)現(xiàn)無(wú)論是天然海水還是人工海水冬季水溫偏高(20℃)雌性青島文昌魚性腺發(fā)育明顯好于雄性。當(dāng)然, 不同緯度海區(qū)文昌魚產(chǎn)卵繁殖的水溫不盡相同: 青島文昌魚繁殖時(shí)水溫 21～25℃,低于 21℃則不產(chǎn)卵[12]; 佛羅里達(dá)文昌魚繁殖時(shí)水溫在 27℃以上, 最適宜溫度在 30～32℃[50]; 歐洲文昌魚繁殖時(shí)水溫為 19～25℃[40], 如果其性腺充分發(fā)育并具備了合適的繁殖生理?xiàng)l件, 適當(dāng)提高水溫會(huì)激發(fā)其產(chǎn)卵[55]。日本Seto Inland Sea西部海域的白氏文昌魚在 21～23℃的水溫時(shí)才會(huì)產(chǎn)卵[56], 而廈門海區(qū)的白氏文昌魚產(chǎn)卵時(shí)水溫通常在25～29℃, 23℃以下時(shí)停止產(chǎn)卵[14]。翁幼竹等[57]進(jìn)一步研究了在不同水溫條件下飼養(yǎng)性腺發(fā)生前的白氏文昌魚, 發(fā)現(xiàn)水溫對(duì)其性腺分化、發(fā)育及產(chǎn)卵與排精影響顯著, 低溫(16℃)有利于文昌魚性腺向雌性分化, 雌雄比例為4.2∶1, 中溫(22℃)和高溫(28℃)則不受影響, 雌雄數(shù)量大致相等, 高水溫則有利于文昌魚的精巢發(fā)育和生精活動(dòng), 28℃海水適于文昌魚的產(chǎn)卵和排精。

3.2.2 光照

光照周期的長(zhǎng)短對(duì)文昌魚生殖細(xì)胞的發(fā)生和性腺生長(zhǎng)及排精與產(chǎn)卵影響較為明顯[28]。方永強(qiáng)等[58]詳細(xì)研究了白氏文昌魚的生殖細(xì)胞發(fā)生和早期性腺生長(zhǎng)與光照周期的關(guān)系, 發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)光照(16 L)有利于文昌魚性腺發(fā)生并加速其生長(zhǎng), 而短光照則效果不明顯。在繁殖季節(jié), 所有文昌魚的產(chǎn)卵都發(fā)生在夜間, 即便是生殖細(xì)胞已經(jīng)全部成熟的文昌魚, 夜間在光照條件下也不會(huì)發(fā)生排精和產(chǎn)卵[46,50], 日落后延遲人工光照2 h可以推遲產(chǎn)卵發(fā)生, 但日落前2h開始暗處理卻并不能使文昌魚產(chǎn)卵提前[59]。光照周期對(duì)文昌魚排精和產(chǎn)卵影響的結(jié)果不盡一致, 長(zhǎng)光照(16L: 8D)不適于白氏文昌魚排精和產(chǎn)卵, 而12 h或8 h光照時(shí)間則有利于其排精和產(chǎn)卵[60], 但是佛羅里達(dá)文昌魚產(chǎn)卵則需要長(zhǎng)光照條件[50]。另外, Holland[33]發(fā)現(xiàn)光照周期對(duì)文昌魚產(chǎn)卵的影響還與季節(jié)有關(guān), 在春季和秋季, 暗刺激可促進(jìn)魯卡偏文昌魚產(chǎn)卵, 但冬季和夏季并無(wú)效果。

3.2.3 鹽度與pH值

文昌魚對(duì)海水鹽度的忍受力比較強(qiáng), 在 25～33范圍內(nèi)都可以正常繁殖[20], 但不同海水鹽度和pH值對(duì)文昌魚精子的運(yùn)動(dòng)方式、壽命有一定影響, 方永強(qiáng)等[61]以白氏文昌魚為材料證實(shí)精子對(duì)低鹽度的耐受力較強(qiáng), 28為其精子運(yùn)動(dòng)的最適鹽度, 低于12或高于42精子就很快死亡; 他們發(fā)現(xiàn)精子對(duì)海水pH值變化較敏感, 偏酸性海水會(huì)迅速引起精子死亡, 偏堿性海水則有激活精子活動(dòng)的作用, 精子活動(dòng)最適pH范圍為8.5～9.0, 稍高于天然海水, 在此范圍內(nèi)精子壽命最長(zhǎng), 也更有利于受精。

3.3 人工催產(chǎn)與授精

至今人們?nèi)圆恢牢牟~繁殖前有什么預(yù)兆,無(wú)法預(yù)測(cè)其確切的產(chǎn)卵日期[35], 只知道文昌魚產(chǎn)卵都發(fā)生在日落以后, 但每天的產(chǎn)卵時(shí)間并不固定。在實(shí)驗(yàn)室條件下, 隨著促使文昌魚產(chǎn)卵的研究報(bào)道逐漸增多, 人們對(duì)文昌魚產(chǎn)卵的誘因也有了初步的了解。在其繁殖季節(jié)通過(guò)各種不同刺激可誘使文昌魚排精和產(chǎn)卵, 針對(duì)白氏文昌魚, 成功的報(bào)道有: 金德祥[45]用極稀的 KOH 處理可使精子激活; 張建等[62]用LRH類似物、方永強(qiáng)等[63]用促性腺激素釋放素類似物GnRH—A注射成熟文昌魚催產(chǎn)均獲得成功, 雌體按預(yù)定效應(yīng)時(shí)間排卵, 雄體排精, 受精卵發(fā)育良好, 可形成大量文昌魚胚胎及幼體; 杜琦等[36]用充氣催產(chǎn)法、流水催產(chǎn)法、激素催產(chǎn)法也得到了滿意的結(jié)果。隨后, 有關(guān)其他文昌魚的人工催產(chǎn)也開始了陸續(xù)報(bào)道, 如Stokes等[48,64]和Holland等[50]用電刺激的方法使佛羅里達(dá)文昌魚產(chǎn)卵獲得成功, Fuentes等[40,55]通過(guò)溫度刺激, 使產(chǎn)過(guò)卵的歐洲文昌魚性腺再次發(fā)育成熟并再次產(chǎn)卵。然而, Yasui等[11]通過(guò)溫度變化刺激、熱刺激、酸堿度變化刺激、滲透壓變化刺激及電刺激等方法促使產(chǎn)自日本的白氏文昌魚產(chǎn)卵的實(shí)驗(yàn)未獲成功, 說(shuō)明文昌魚的種類和產(chǎn)地的不同其相應(yīng)的催產(chǎn)條件也會(huì)不同。

有關(guān)文昌魚通過(guò)人工授精獲得受精卵的報(bào)道不多, 最早進(jìn)行文昌魚人工授精工作的是童第周等[7-8],他們1952年通過(guò)解剖性腺發(fā)育成熟的青島文昌魚成功獲得了正常發(fā)育人工授精的卵子。后來(lái), 金德祥用玻璃針或縫花針挑破白氏文昌魚的卵巢, 讓卵子分散在海水中然后放入精子, 只需要 3～5 s, 就可完成受精[45]; Holland等[50,65]以佛羅里達(dá)文昌魚為材料用直流電脈沖刺激2 s可誘發(fā)部分文昌魚產(chǎn)卵, 且其受精能力可保持大約2 h。

3.4 卵的收集與孵化

不同種類和產(chǎn)地的文昌魚的繁殖日期差別很大,在文昌魚的產(chǎn)卵季節(jié)每天傍晚檢查其產(chǎn)卵情況。一般情況下雄性文昌魚先從沙中游出, 并在水面上快速游動(dòng)并完成排精, 然后雌文昌魚游出排卵。將雌性文昌魚迅速撈出, 使其排卵于平皿中, 用含有文昌魚精子的海水使其受精, 以無(wú)菌海水洗滌受精卵后,讓其在室溫下自然發(fā)育[17]。在文昌魚產(chǎn)卵當(dāng)晚結(jié)束時(shí), 可用150～200目尼龍篩絹過(guò)濾養(yǎng)殖缸(箱)的海水,收集其受精卵或胚胎。所收集的受精卵或胚胎經(jīng)無(wú)菌海水洗滌數(shù)次, 然后將受精卵或胚胎放入新鮮海水中進(jìn)行孵化, 密度控制在5～10個(gè)/mL[12]。受精卵孵化和幼蟲發(fā)育與水溫有關(guān), 青島文昌魚的胚胎在 18 ℃以上才能正常發(fā)育, 并隨著溫度的升高而加快, 但超過(guò)34 ℃ 胚胎解體, 低于 14℃ 發(fā)育受阻[66]。正常溫度下, 從受精到胚胎出膜變?yōu)楦∮斡紫x約10～12 h, 2～3 d后幼蟲開口成為幼體, 出現(xiàn)第一個(gè)鰓孔, 頭部吻端清晰可見, 胃腸已發(fā)育, 并開始攝食[14,47]。

4 幼體飼養(yǎng)與管理

幼體從浮游生活到鉆沙變?yōu)闋I(yíng)底棲生活, 是文昌魚生活史中最重要的轉(zhuǎn)折, 文昌魚人工育苗的死亡高峰期即出現(xiàn)于此[38], 開口后有約 40%的幼體在第3個(gè)初級(jí)鰓裂出現(xiàn)之前就夭折[20]。幼體飼養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵是除了水質(zhì)條件外, 能否提供質(zhì)優(yōu)、適口的餌料及適宜的飼養(yǎng)密度十分重要。吳賢漢等[37]報(bào)道文昌魚幼體以 1～2 個(gè)/mL的密度放在含細(xì)沙(透過(guò)40目篩絹)或不含沙的容器中培養(yǎng), 每日投喂單胞藻, 藻液最終濃度為104個(gè)細(xì)胞/mL, 每次投餌前需更換1/2過(guò)濾的海水。至于餌料的選擇, 不同研究者差異較大, 可能與文昌魚種類與產(chǎn)地的生活習(xí)性相關(guān)。對(duì)于青島文昌魚, 吳賢漢等[37]發(fā)現(xiàn)投喂藍(lán)藻、小球藻, 其幼蟲無(wú)一變態(tài), 在實(shí)驗(yàn)開始的一周內(nèi)全部死亡, 而喂養(yǎng)等鞭金藻兩個(gè)月后仍存活7%并已完成變態(tài)。Stokes等[64]將佛羅里達(dá)文昌魚幼體放在直徑 14 cm的培養(yǎng)皿, 每天用后棘藻和等鞭金藻的混合液(最終濃度5×106個(gè)細(xì)胞/mL)喂養(yǎng), 效果良好。Yasui等[11]在產(chǎn)于日本的白氏文昌魚幼體開口時(shí)用纖細(xì)角毛藻和鹽藻的混合液喂養(yǎng), 大約 100 d后改用單獨(dú)的纖細(xì)角毛藻或Chaetoceros calciteorance喂養(yǎng)在3 L的塑料容器, 發(fā)現(xiàn)放置5 cm厚的細(xì)沙較33 L玻璃容器不放細(xì)沙的成活率高。周仁杰等[38]根據(jù)廈門的白氏文昌魚幼體不同發(fā)育階段以不同藻類作為餌料進(jìn)行喂養(yǎng)取得了可喜的效果, 其53 d的育苗成活率達(dá) 20.7%, 且存活幼體幾乎可全部潛沙生活, 并實(shí)施了國(guó)內(nèi)外首次的文昌魚資源人工增殖放流。他們的做法是: 選用湛江叉鞭金藻作為文昌魚浮游幼體的開口餌料, 幼體發(fā)育至出現(xiàn) 6個(gè)鰓裂之前, 其餌料一直以湛江叉鞭金藻為主, 每次投喂量約為3.5萬(wàn)個(gè)/mL, 輔之以少量小球藻; 6～12個(gè)鰓裂階段以湛江叉鞭金藻和牟氏角毛藻為主, 每次投喂量約為4.0萬(wàn)個(gè)/mL, 輔之以少量小球藻; 出現(xiàn) 12個(gè)鰓裂以后以青島大扁藻為主, 每次投喂量約為0.3萬(wàn)個(gè)/mL, 輔之以少量小球藻以及湛江叉鞭金藻或牟氏角毛藻。

幼體發(fā)育到8鰓裂以上, 可以開始加細(xì)沙以便于幼體變態(tài)后能及時(shí)潛入沙中, 為了便于清理, 起始階段細(xì)沙層不宜厚, 應(yīng)控制在1 cm以下[20]。飼養(yǎng)幼體的容器每過(guò)一段時(shí)間就會(huì)沉積食物殘?jiān)⒂左w排出的糞便及死亡的幼體, 必須及時(shí)清理。幼體營(yíng)浮游生活時(shí),先把水體上層干凈的海水連同浮在水體中的幼體倒入另一干凈的容器, 下層部分可用 300目篩絹過(guò)濾,將濃縮物轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿, 解剖鏡下用吸管將臟東西吸去, 留下幼體。幼體營(yíng)潛沙生活時(shí), 分批把少量的細(xì)沙連同文昌魚一起放到大的培養(yǎng)皿中, 然后加入適量的干凈海水, 輕輕搖動(dòng), 趁文昌魚露出沙面后, 把海水連同文昌魚一起倒出到另一器皿, 不斷重復(fù)直到細(xì)沙里文昌魚全部篩出為止[22]。隨著文昌魚的生長(zhǎng)發(fā)育,個(gè)體逐漸增大, 應(yīng)增厚沙層, 并適當(dāng)添加飼養(yǎng)成體用的細(xì)沙(直徑0.5～1 mm)。其他管理類同親體, 保持通氣, 每天投喂餌料一次, 投餌前更新部分海水。

5 展望

子二代文昌魚的成功獲得, 實(shí)現(xiàn)了文昌魚實(shí)驗(yàn)室連續(xù)繁育[14,20], 為文昌魚人工增養(yǎng)殖奠定了基礎(chǔ)。從目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看, 只要餌料、溫度和水質(zhì)狀況得到改善和加以適當(dāng)?shù)目刂? 以人工海水、河沙在內(nèi)陸開展實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)文昌魚并使其產(chǎn)卵和排精也是完全可能的。通過(guò)深入研究各種文昌魚的生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律及其各種生態(tài)因子的影響, 進(jìn)一步發(fā)展和完善文昌魚人工飼養(yǎng)與繁殖技術(shù), 人為控制和改變文昌魚的生長(zhǎng)發(fā)育周期, 完全可以實(shí)現(xiàn)文昌魚每年多次產(chǎn)卵的目的,達(dá)到文昌魚的全人工繁育目標(biāo), 以徹底擺脫對(duì)野生文昌魚親體資源的依賴, 并通過(guò)實(shí)施文昌魚的人工增殖放流, 為文昌魚資源恢復(fù)和開發(fā)利用提供保障。

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(本文編輯: 譚雪靜)

Q959.287

A

1000-3096(2014)01-0107-07

10.11759/hykx20130520001

2013-05-20;

2013-07-17

國(guó)家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目(2008AA092604);山東省自然基金資助項(xiàng)目(ZR2010CM030); 山東省教育廳科技計(jì)劃資助項(xiàng)目(J08LE03)

張勁松(1964-), 女, 山東單縣人, 高級(jí)實(shí)驗(yàn)師, 主要從事教學(xué)與實(shí)驗(yàn)室管理方面的研究, E-mail: zhangjinsongw@sina.com ; 王昌留, 通信作者, 教授,Email: changliuwang@sina.com