李 清, 臧曉南, 張學成 , 宋曉金, 楊 青

(1. 中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島 266003; 2. 中國科學院 青島生物能源與過程研究所, 山東 青島 266101; 3. 青島科技大學, 山東 青島 266042)

裂殖壺菌OUC88及10個派生菌株18S rDNA基因克隆和分析

李 清1, 臧曉南1, 張學成1, 宋曉金2, 楊 青3

(1. 中國海洋大學 海洋生命學院, 山東 青島 266003; 2. 中國科學院 青島生物能源與過程研究所, 山東 青島 266101; 3. 青島科技大學, 山東 青島 266042)

用PCR方法從裂殖壺菌Schizochytrium limacinumOUC88及以其為出發(fā)菌株經紫外誘變篩選的10個菌株中擴增出 18S rDNA 基因序列(1751bp到 1758bp)進行序列測定, 以上序列已登錄GenBank(HM042904-HM042914)并與已登錄的裂殖壺菌屬5條18S rDNA 序列比對分析。結果表明,S. limacinumOUC88以及10個派生菌株間18S rDNA的遺傳距離是0.000～0.013, 與Schizochytriumsp. FJU-512 18S rDNA (GenBank No.AY758384)的同源性最高, 為 98%～99%; 與S. limacinum(GenBank No.AB022107)的同源性為96%; 與同屬異種S. mangrovei(GenBank No.DQ100293)只有93%的同源性。并運用序列比對分析和 MEGA4.0系統(tǒng)進化樹, 結果顯示種內誘變產生的細微變異小于同屬內不同物種之間的變異。本研究除了為裂殖壺菌這種重要的經濟海洋真菌提供分子生物學資料以外, 同時表明18S rDNA序列不僅在分子分類上是一個重要的標志, 也可分析由突變引起的物種內細微的遺傳變異。關鍵詞: 裂殖壺菌OUC88; 18S rDNA; 基因克隆; 序列比對分析; 進化樹

二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)是一種極其重要的 ω-3系列不飽和脂肪酸, 具有抗心血管病、抗癌、抗血脂、促進智力發(fā)育和保護視力等重要生理作用[1-5]。DHA的傳統(tǒng)來源是海洋魚油[6],而海洋魚油的產量和脂肪酸組成隨捕撈的季節(jié)、產地、魚種不同而發(fā)生改變。魚油無論是數(shù)量還是質量都難以滿足人們對DHA的需求。利用破囊壺菌科的海洋真菌生產DHA已成為海洋生物技術的研究熱點[7-11]。

裂殖壺菌(Schizochytrium)是屬于網粘菌門(Labyrinthulomycota)、網粘菌綱(Labyrinthulomycetes)、破囊壺菌目(Thraustochytriales)、破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)的一類類藻的海洋真菌。目前已有5個種被命名, 分別是:S. aggregatum、S. minutum、S. octosporum、S. limacinum和S. mangrovei。其中,S. limacinum從西太平洋沿岸的紅樹林地區(qū)分離得到[12],單細胞, 球形, 細胞內積累了大量的油脂, 總脂肪酸中不飽和脂肪酸含量很高, 主要為 ω-3不飽和脂肪酸—DHA, 而其他的不飽和脂肪酸含量甚微; 且細胞中 90% 以上的油脂以人體易吸收的中性油脂——甘油三脂(TG)的形式存在[13]。因此, 裂殖壺菌成為一種理想的DHA新生資源而備受關注。

裂殖壺菌研究時間不長, 又有重要的經濟價值,鑒定及分類是一個重要的問題。海洋真菌傳統(tǒng)分類方法只是基于簡單的形態(tài)學特征, 存在許多爭議,制約了相關研究的深入。分子標記技術的發(fā)展, 使DNA分子成為區(qū)分物種、變種、地理株的有效手段。目前 18S rDNA由于其在一級結構中的多拷貝及高變區(qū)域的高度保守等優(yōu)點而被廣泛用于分子系統(tǒng)學研究[14-18], 利用18S rDNA序列變化可以探究生物種間和種內的親緣關系、系統(tǒng)進化以及鑒定未知的種屬等問題, 已成為海洋真菌重要的分子標記[19-25]。在海洋真菌裂殖壺菌屬中除了S. octosporum沒有得到18S rDNA序列, 其他四個種都得到了一條或多條18S rDNA序列。利用這些序列信息可以確定一些新發(fā)現(xiàn)菌株的分類地位, 以及與其他菌種的親緣關系和變異情況。

目前的研究報道表明, 在真菌類鑒定中, 用18S rDNA序列分析方法一般只能將菌株鑒定到屬, 能否鑒定到種一直沒有定論。本實驗用S. limacinumOUC88[8-9]及由其連續(xù)誘變篩選的 10個生長性狀、DHA產量差異較大的突變菌株為材料, 克隆擴增18S rDNA, 分析比較該基因在突變菌株之間、突變菌株與出發(fā)菌株之間的異同。因為基因突變是產生新生物基因的根本來源, 也是產生生物多樣性的根本來源。經過誘變篩選, 突變菌株是否突破了種間距離有待于深入研究。同時以裂殖壺菌Schizochytriumsp. FJU-512(GenBank No.AY758384)[22-23],S. limacinum(GenBank No.AB022107)[24],S. mangroveei(GenBank No.DQ100293),S. aggregatum(GenBank No. DQ023617) ,S. minutum(GenBank No.AB022108)[24],破囊壺菌Thraustochytriumsp. FJN-10(GenBank No. AY773276)[25],釀酒酵母Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632(GenBank No.EU011664)[26]的18S rDNA 序列作為對照, 比較他們之間的遺傳距離, 并為18S rDNA序列分析方法在真菌菌株鑒定中的應用提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

以S. limacinumOUC88[8-9]為出發(fā)菌株, 經紫外誘變篩選得到OUC101、OUC109、OUC166、OUC168、OUC169、OUC174、OUC175、OUC191、OUC192和OUC196等10個派生菌株(表1)。其中OUC 175產量高, 壁薄, DHA含量高; OUC168產量高, 壁厚, DHA含量高, 沉降好; OUC 101, OUC109, OUC191, OUC192和 OUC196的脂肪酸和 DHA含量介于OUC88和OUC168, OUC175之間; OUC166, OUC169和OUC174的脂肪酸和DHA含量相對較低。以上材料都由本實驗室提供。

E. coliDH 5α, PCR Amplification Kit和pMD-18-T Simple Vector購自 TaKaRa公司, 瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自天根公司; PCR擴增采用BIO-RAD PCR儀, PCR產物由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)

固體培養(yǎng)基(g/L) : Glucose 60, Agar powder 20, Yeast extract 20, 蒸餾水和海水體積比為1∶1; 發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L): Glucose 70, Yeast extract 20, Monosodium glutamate 20, 蒸餾水和海水比為1∶1, 培養(yǎng)溫度23℃, 搖瓶轉速200 r/min, pH (6.0), 培養(yǎng)時間72 h。

表1 實驗菌株的來源、方法和參考文獻Tab.1 Source and references of experimental strains

1.2.2 總DNA的提取[8]

采用裂解法(Lysis法)提取總DNA。取適量培養(yǎng)2～3 d的菌體, 液氮研磨后加入10 mL預熱的CTAB提取液(0.1 mol/L Tris-Cl pH 8.0, 0.02 mol/L EDTA, 0.5 mol/L NaCl, 1.5%SDS), 劇烈混勻, 60℃水浴30～60 min, 酚/氯仿去蛋白, 乙醇沉淀, 加 TE溶解沉淀, RNaseA去RNA, 電泳檢測后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 18S rDNA的擴增和測序

采用TaKaRa PCR Amplification Kit, 按操作說明進行PCR, 擴增引物為18SF: 5′CCAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA 3′和18SR: 5′CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT 3′[17], 擴增參數(shù)為: 94℃預變性5 min; 94℃變性30 s, 52℃復性30 s, 72℃延伸2 min, 30個循環(huán); 72℃充分延伸10 min, 4℃保存。PCR擴增產物采用天根公司的瓊脂糖凝膠 DNA回收試劑盒回收,連接體系依據(jù) TaKaRa連接試劑盒 pMD18-T Simple Vector的使用說明進行。連接產物轉化E.coliDH 5α感受態(tài)細胞, 用通用引物M13篩選陽性重組子, 陽性克隆送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.4 序列分析和系統(tǒng)樹的構建

將測序得到的基因序列, 用NCBI 網站上Blast軟件進行序列比對。然后采用MEGA4.0軟件將其與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報道的相似序列進行比對并采用鄰接法 (neighbor-joining method) 獲得系統(tǒng)樹,重復計算1000次得到系統(tǒng)樹拓撲結構的支持。

1.3 對比序列

為了比較, 還從 Genbank數(shù)據(jù)庫及參考文獻得到裂殖壺菌屬中5條18S rDNA基因序列, 即Schizo

chytriumsp. FJU-512(GenBank No.AY758384)[22-23],S. limacinum(GenBank No.AB022107)[24],S. mangrovei(GenBank No.DQ100293),S. aggregatum(GenBank No.DQ023617),S. minutum(GenBank No.AB022108)[24],以及作為群外參照的破囊壺菌Thraustochytriumsp. FJN-10(GenBank No.AY773276)[25]和 釀 酒 酵 母Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632(Gen-Bank No.EU011664)[26]的18S rDNA 序列各一條。這些資料也列于表1中。

2 實驗結果

2. 1 18S rDNA基因PCR擴增

取Lysis法提取的11株裂殖壺菌的總DNA為模板進行 PCR擴增, 擴增產物通過 1%的瓊脂糖凝膠(EB染色)電泳檢測, 結果如圖1, 條帶清晰且沒有雜帶, 長度約1 750bp。將片段回收并轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中, 篩選陽性克隆測序。

圖1 18S rDNA電泳圖像Fig. 1 Electrophoresis patterns of 18S rDNA

2.2 18S rDNA基因序列分析

經DNAMAN整理后得到11株裂殖壺菌完整的18S rDNA基因序列, 序列大小在1 751bp到1 758bp,將其提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中得到GenBank 號如表2所示。經Blast同源性比對, 它們與Schizochytriumsp. FJU-512(GenBank No.AY758384, 破囊壺菌科, 裂殖壺菌屬)[22-23]同源性最高, 在 98%～99%; 與S.limacinum(GenBank No. AB022107)[24]具有96%的同源性;與S. mangrovei(GenBank No.DQ100293)、S. minutum(GenBank No.AB022108)[24]分別具有93%和86%的同源性; 與S. aggregatum(GenBank No.DQ023617)具有 82%～85%同源性; 與Thraustochytriumsp. FJN-10(GenBank No.AY773276, 破囊壺菌科, 破囊壺菌屬)[25]具有91%的同源性; 與Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632(GenBank No. EU011664,酵母菌科, 酵母菌屬, 釀酒酵母菌)[26]具有 81%～84%的同源性, 如表2所示。

將S. limacinumOUC88等11株裂殖壺菌18S rDNA基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中已知的Schizochytriumsp. FJU-512、S. limacinum(GenBank No.AB022107)[24]、S. mangrovei(GenBank No.DQ100293)、S. aggregatum(GenBank No.DQ023617)、S. minutum(GenBank No. AB022108)[24]、Thraustochytriumsp. FJN-10和Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632的18S rDNA基因序列進行比對, 利用 MEGA4.0 做出了它們的遺傳距離表,如表3。

表 3顯示 11株裂殖壺菌的 18S rDNA序列與Schizochytriumsp. FJU-512的遺傳距離在0.001～0.010之間; 與S. limacinum的遺傳距離為 0.019～0.026; 與S. mangrovei的遺傳距離為0.046～0.052; 與S. aggregatum的遺傳距離為0.239～0.241; 與S. minutum的遺傳距離為0.212～0.216; 與Thraustochytriumsp. FJN-10間的遺傳距離為0.072～0.077; 與Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632的遺傳距離為0.265～0.272。

11株裂殖壺菌之間也存在差異, 其中 OUC88與OUC174、OUC192、OUC101、OUC196的遺傳距離是0.007, 與OUC166的遺傳距離是0.008, 與OUC168的遺傳距離是0.010, 與OUC109、OUC191的遺傳距離是0.012, 與OUC169、OUC175的遺傳距離是0.013。

2.3 分子系統(tǒng)樹的構建

基于所得到的數(shù)據(jù), 以釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632為外類群進行系統(tǒng)發(fā)育分析。應用NJ 法(Kimura 2-parameter) 構建了分子系統(tǒng)發(fā)育關系樹(NJ 樹, 圖2), “Bootstrap”進行1 000次以檢驗分枝的置信度。枝上數(shù)字為1 000 次bootstrap分析的支持百分率, 其數(shù)值越高, 支持率越高, 樹的置信度越高。

表2 11株裂殖壺菌的18S rDNA序列長度, GenBank號以及同源性比較Tab. 2 The length, GenBank No. and Max. identity of 18S rDNA gene from S .limacinum

表3 18S rDNA遺傳距離 (左下角為遺傳距離, 右上角為標準誤)Tab.3 Genetic distance (lower-left) and SE (upper-right) of 18S rDNA using Kimura-2-parameter

由圖 2看出, 釀酒酵母菌Saccharomyces cerevisiaestrain NRRL Y-12632作為外類群位于進化樹的底部,S. minutum與Saccharomyces cerevisiae聚為一支,S. limacinum與S. mangrovei聚為一支。S. limacinumOUC88及由其紫外誘變得到的10個派生菌株以 100%的置信度聚為一支。其中 OUC88與OUC174、OUC192、OUC101、OUC196、OUC166; OUC109、OUC191、OUC169、OUC175與 OUC168聚為一支。OUC101與Schizochytriumsp. FJU-512聚為一支。根據(jù)黃建忠[23]中結果Schizochytriumsp. FJU-512與S.limacinum具有大于98 %同源性, 在進化樹中與S.limacinum距離最近,進化關系最密切。這一結果在本實驗中也得到了進一步的證明, 可知Schizochytriumsp. FJU-512 應該屬于S.limacinum。11株裂殖壺菌與Schizochytriumsp. FJU-512聚為一支, 與S. limacinum親緣關系最近, 與S. mangrovei次之, 與S. aggregatum和S. minutum最遠。

圖2 18S rDNA的分子系統(tǒng)樹(鄰接樹)Fig.2 Molecular phylogenetic tree of 18S rDNA (Neighbor-Joining tree)

3 分析與討論

(1) 本實驗測定了 11株裂殖壺菌完整的18SrDNA基因序列, 序列大小在1751bp到1758bp。提交到GenBank數(shù)據(jù)庫中得到GenBank 登錄號。這為裂殖壺菌屬18S rDNA序列增添了新的信息內容,為其他菌株 18S rDNA序列比對和鑒定提供了更多的選擇, 擴展了該屬的分子系統(tǒng)學資料。

(2) 分析種內遺傳差異, 并與種間差異進行量化比較

現(xiàn)代生物進化理論中, 突變、重組、自然選擇及隔離是物種形成和生物進化的基礎, 其中突變?yōu)樯镞M化提供大量的原材料,也是生物變異的根本來源。基因突變是指DNA分子結構的改變, 即基因內部脫氧核苷酸的排列順序發(fā)生改變。根據(jù)突變發(fā)生的條件可分為自然突變和誘發(fā)突變兩類。而紫外誘變就是一種應用廣泛、效果明顯的誘變方法。它的誘變頻率高, 而且不易回復突變, 是微生物育種中最常用和有效的誘變方法之一。

在本實驗中,S. limacinumOUC88是Schizochytrium limacinumSR21的紫外突變株, 其他10個菌株由OUC88紫外誘變分離單菌落得到, 它們經過紫外誘變后生物性狀(生物量, 脂肪酸含量和 DHA含量等)都發(fā)生了很大改變。根據(jù)海洋真菌重要的分子標記18S rDNA序列, 分析由于突變形成的種內遺傳差異, 并與種間差異進行了量化比較。

以S. limacinumOUC88為出發(fā)菌株, 經過紫外誘變得到 10個突變菌株, 比較出發(fā)菌株和突變菌株的18S rDNA序列, 顯示它們之間的遺傳距離為0.000到0.013, 遠 小 于 與S. limacinum的 遺 傳 距 離0.019～0.026。其中 OUC88與 OUC174、OUC192、OUC101、OUC196的遺傳距離是0.007, 與OUC166的遺傳距離是0.008, 它們以 91%置信度聚為了一支;而OUC88與OUC109、OUC191的遺傳距離是0.012,與OUC169、OUC175的遺傳距離是0.013, 與OUC168的遺傳距離是 0.010, 這 5個菌株聚為一支。其中OUC174與OUC192遺傳距離為0.000, 兩個菌株親緣關系最近; OUC101與Schizochytriumsp FJU-512遺傳距離為0.002, 聚為一支。

從遺傳距離上看, 11株裂殖壺菌的18S rDNA序列與S. limacinum的遺傳距離為0.019～0.026, 與S. mangrovei的遺傳距離為0.046～0.052, 小于S. limacinum、S. mangrove兩種間距離0.053; 與S. aggregatum的遺傳距離為 0.239～0.241, 小于種間距離0.252; 與S. minutum的遺傳距離為0.212～0.216, 小于種間距離0.225。由分子系統(tǒng)樹看, 11株裂殖壺菌與S. limacinum親緣關系最近, 同源性比較也高達96%; 與S. aggregatum的親緣關系比S. minutum近,這與同源性比較和遺傳距離顯示的結果矛盾, 分析原因可能是在GenBank數(shù)據(jù)庫中S. aggregatum18S rDNA含有100 多個未知堿基, 實際上11株裂殖壺菌與S. aggregatum的遺傳距離應小于0.244, 同源性比較應該高于82%～85%同源性。

S. minutum與Saccharomyces cerevisiae遺傳距離為0.159, 在進化樹中與Saccharomyces cerevisiae聚為一支, 但是它們分屬于不同的物種, 形態(tài)、生理、代謝等方面差異大, 所以18S rDNA分子標記技術與傳統(tǒng)的分類學方法相結合才能更好的判定親緣關系。

利用 16S rDNA序列作為分子標記時, 其中99%～100%全序列相似的判定為一個種, 97%～99%全序列相似的判定為一個屬[27-28]。18S rRN A序列作為劃分科級階元的工具時, 當位于同一分支上互成姐妹群的類群間的遺傳距離超過 1% 時, 這幾個類群屬于不同的科[29]。雖然有文獻報道, 在真菌類鑒定中,用 18S rDNA序列分析方法鑒定菌株一般只能鑒定到屬[29-30], 但是本實驗結果表明出發(fā)菌株與10個突變菌株 18S rDNA 序列遺傳距離雖然有一定差距,但是變化沒有超過S. limacinum種間的尺度, 仍然屬于S. limacinum。本文結果表明18S rDNA序列不僅在分子分類上是一個重要的標志, 也可分析由突變引起的物種內細微的遺傳變異。

(3) 誘變育種或轉基因等基因工程育種可能帶來生物基因的改變, 進而影響其形態(tài)和生物特性,創(chuàng)造人類需要的變異類型, 這種變化是否可以脫離物種的范圍, 創(chuàng)造新物種還是一個有爭議的問題。本研究結果表明裂殖壺菌經誘變選育獲得的10個突變菌株, 雖然在形態(tài)和性狀上與出發(fā)菌株有很大變化,但是經 18S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)他們的遺傳距離變化很小, 仍沒有超出物種的范圍, 因此我們認為基因工程育種可能帶來生物基因的改變, 但尚沒有證據(jù)表明可以創(chuàng)造新物種, 因為新物種的形成, 需要這些進化材料的長期積累和隔離的過程[31]。本文結果進一步表明18S rDNA序列鑒定可作為誘變、轉基因等基因工程育種后物種鑒定的有效方式。

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(本文編輯: 張培新)

Cloning and analysis of 18S rDNA gene fromSchizochytrium limacinumOUC88 and 10 derived strains

LI Qing1, ZANG Xiao-nan1, ZHANG Xue-cheng1, SONG Xiao-jin2, YANG Qing3
(1. College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Qingdao Institute of Biomass Energy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China; 3. Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

Oct.,16,2012

SchizochytriumlimacinumOUC88; 18S rDNA; gene cloning; sequence analysis; phylogenetic

18S rDNA genes with length between 1751bp and 1758bp (GenBank : HM042904-HM042914) were cloned fromSchizochytrium limacinumOUC88 and its 10 derived strains by PCR. By sequencing and blasting with other 18S rDNA genes ofSchizochytriumfrom GenBank database, the genetic distances ofS. limacinumOUC88 and its derived strains were between zero and 0.013, and their identity was between 98% and 99% withSchizochytriumsp FJU-512 (GenBank No.AY758384), 96% withS. limacinum(GenBank No. AB022107) and 93% withS. mangrovei(GenBank No.DQ100293), respectively. By sequence analysis and the phylogenetic tree built up by MEGA4.0, the results showed that slight variation in mutation was less than in different species. These have provided molecular biology data for this important economic marine fungi. Furthmore, the results showed that the 18S rDNA sequence was not only an important sign in molecular classification, but also can be used to analyze slight genetic variation caused by mutation.

Q75

A

1000-3096(2014)01-0071-08

10.11759/hykx20130112003

2012-10-16;

2013-01-03

國家863計劃項目(2008AA09Z410); 國家科技支撐計劃項目(2006 BAD09A12)

李清(1986-), 女, 碩士研究生, 現(xiàn)從事裂殖壺菌脂肪酸合成分子調控研究, E-mail:liqing202020@126.com; 通信作者: 臧曉南, 女,副教授, 碩士生導師, E-mail: xnzang@ouc.edu.cn. 電話: 0532-82032789