駱慧盈，李傳連，樓哲豐，鄭九嘉，張李雅，金龍金

（1.浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.婁底市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 婁底 417000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

mtND5基因12338、12358和12406位點(diǎn)突變與弱精子癥的相關(guān)性分析

駱慧盈1，李傳連2，樓哲豐1，鄭九嘉3，張李雅3，金龍金1

（1.浙江省醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.婁底市中心醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖南 婁底 417000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 生殖醫(yī)學(xué)中心，浙江 溫州 325015）

目的：探討mtND5基因12338、12358和12406位點(diǎn)突變與弱精子癥的相關(guān)性。方法：按照WHO標(biāo)準(zhǔn)收集55例弱精子癥患者和33例精子活力正常者的精液標(biāo)本，通過PCR及測序檢測mtND5基因12338、12358和12406三個(gè)位點(diǎn)的突變，分析比較兩組基因突變頻率及活力的差異。結(jié)果：弱精子癥組中精子mtND5 12338突變率（為10.91%）、12358突變率（為9.09%）、12406突變率（為12.73%）和三位點(diǎn)總突變率（為32.73%）均高于正常對(duì)照組（分別為9.09%、3.03%、3.03%和15.15%），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。進(jìn)一步分析兩組的精子活力發(fā)現(xiàn)，突變組與非突變組a級(jí)精子百分率分別為（20.63±13.63）%、（30.61±18.87）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；a+b級(jí)精子百分率分別為（29.66±17.08）%、（41.44±22.47）%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A可能與精子活力有一定的相關(guān)性。

弱精子癥；精子活動(dòng)力；mtND5；突變

不孕不育是一種嚴(yán)重影響人類生殖健康的疾病，且其中約有一半的原因是男性因素所致，稱為男性不育。由于生活方式的改變、社會(huì)工業(yè)的不斷發(fā)展及環(huán)境污染的加劇，男性不育患者日趨增加[1]。目前，它已成為一個(gè)全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題。

據(jù)Hirsh[2]報(bào)道，男性不育癥中約有一半是由于男方精子質(zhì)量異?；蛐怨δ苷系K所致。其中精子質(zhì)量低下是其重要原因之一，而精子活動(dòng)力則是衡量精子質(zhì)量的一項(xiàng)重要指標(biāo)。依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)[3]，精子活力分為4個(gè)等級(jí)：a級(jí)為快速前向運(yùn)動(dòng)精子，b級(jí)為慢速前向運(yùn)動(dòng)精子，c級(jí)為原地運(yùn)動(dòng)精子，d級(jí)為靜止精子。當(dāng)a級(jí)＜25%且a+b＜50%時(shí)，可診斷為弱精子癥。精子活動(dòng)的能量主要源自線粒體，當(dāng)線粒體結(jié)構(gòu)或功能異常時(shí)，精子活力會(huì)受到一定影響。

近年來，mtDNA突變和缺失與男性不育的相關(guān)研究越來越多的引起關(guān)注。有關(guān)精子線粒體基因突變與精子活力低下的相關(guān)研究已有一些報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室已往的研究中也曾報(bào)道m(xù)tATPase基因變異[4]，mtND2、mtND3和mtND4L基因突變[5-6]與精子活力低下可能有一定相關(guān)性。迄今為止，對(duì)mtND5基因的研究陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，mtND5基因突變與Leber遺傳性視神經(jīng)病變、遺傳性肥厚性心肌病有一定相關(guān)性，然而，mtND5基因點(diǎn)突變與弱精子癥的相關(guān)性研究國內(nèi)外尚鮮有報(bào)道。為了解mtND5基因變異與弱精子癥的相關(guān)性，本研究通過基因測序檢測到mtND5 12338、12358和12406三個(gè)位點(diǎn)的突變，并對(duì)這三個(gè)突變位點(diǎn)與弱精子癥的相關(guān)性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步分析mtND5基因突變與弱精子癥的相關(guān)性提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象弱精子癥和正常對(duì)照組精液標(biāo)本來自溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，根據(jù)WHO修訂標(biāo)準(zhǔn)，通過計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)（CASA）分析，選取精子活力低下（a級(jí)＜25%且a+b級(jí)＜50%）患者55例，正常對(duì)照標(biāo)本（a級(jí)＞25%或a+b級(jí)＞50%）33例，所有精液標(biāo)本在采集前禁欲3～5 d，手淫法收集，在37 ℃孵育20～30 min，待其完全液化后進(jìn)行分析。所有病例和對(duì)照均簽訂知情同意書。

1.2 主要試劑PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)[7]，上游5’-TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG-3’，下游5’-AGA AGG TTA TAA TTC CTA CG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為866 bp。引物由寶生物（大連）工程有限公司合成。PCR聚合酶試劑、DNA片段純化試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K為Merk公司產(chǎn)品；瓊脂糖、Tris試劑為Promega公司進(jìn)口分裝。

1.3 方法

1.3.1 精子線粒體DNA的提?。河肞BS洗滌已液化的精液標(biāo)本2～3次，56 ℃消化4～6 h，酚-氯仿法抽提精子線粒體DNA，Elution Buffer溶解。

1.3.2 PCR反應(yīng)和產(chǎn)物鑒定：2μ L DNA模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，MgCl2（25 μmol/L）3 μL，PCR（10×）緩沖液4 μL，dNTP（200 nmol/L）4μL，Taq聚合酶（5μmol/L）0.25 μL，ddH2O補(bǔ)足至40μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃終止延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3.3 PCR產(chǎn)物的純化和測序：按寶生物工程（大連）有限公司DNA片段純化試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化，然后送上海鼎安生物科技有限公司進(jìn)行正向測序。

1.4 突變分析利用CodonCode Aligner軟件將測序結(jié)果與Mitomap數(shù)據(jù)庫（www.mitomap.org）上提供的人類線粒體劍橋序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)檢測出的核苷酸變異位點(diǎn)進(jìn)行仔細(xì)核對(duì)峰圖確認(rèn)。將突變前后的密碼子編碼的氨基酸性質(zhì)進(jìn)行分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS17.0軟件將序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間突變率的比較采用卡方檢驗(yàn)，精子活力的比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示與預(yù)期產(chǎn)物片段大小一致（見圖1）。

圖1 mtND5基因PCR產(chǎn)物電泳圖

圖2 mtND5 m.12338T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突變測序峰圖

2.2 序列比對(duì)和突變頻率分析測序結(jié)果與修正后劍橋序列進(jìn)行比對(duì)，55例弱精子癥患者中mtND5基因的3個(gè)位點(diǎn)，分別發(fā)生了m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突變（見圖2），與正常對(duì)照組相比，三個(gè)位點(diǎn)的突變頻率及總變異率均高于對(duì)照組（見表1），但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。我們進(jìn)一步對(duì)88例樣本分為突變組和非突變組，并對(duì)這兩組的精子活動(dòng)力數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)突變組的a級(jí)精子百分率和a+b級(jí)精子百分率顯著低于非突變組（P＜0.05）（見表2）。

2.3 mtND5基因錯(cuò)義突變氨基酸性質(zhì)分析通過Mitomap數(shù)據(jù)庫查找分析，發(fā)現(xiàn)三個(gè)突變位點(diǎn)中，m.12358 A＞G突變使極性親水性氨基酸（蘇氨酸）變?yōu)榉菢O性疏水性氨基酸（丙氨酸），而另外兩個(gè)突變位點(diǎn)僅發(fā)生所編碼的氨基酸改變，無極性改變（見表3）。

表1 mtND5 m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突變在弱精子癥組和正常對(duì)照組中的突變率

表2 突變組與非突變組a級(jí)、a+b級(jí)精子百分率的比較（%）

表3 mtND5基因三個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)的氨基酸極性改變

3 討論

ND5是氧化呼吸鏈NADH-脫氫酶復(fù)合體的七個(gè)亞基之一，與細(xì)胞能量代謝有關(guān)。精子的活力強(qiáng)弱在受精中起著重要的作用，只有在快速前向運(yùn)動(dòng)的精子達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，才能與卵子結(jié)合形成受精卵。若精子能量代謝障礙，則可能會(huì)產(chǎn)生精子活力降低，導(dǎo)致生殖障礙。

ND5亞基對(duì)于復(fù)合體I的活性是不可或缺的[8-9]。mtND5基因經(jīng)常被報(bào)道于各種各樣的表型，包括MELAS、LHON、MERRF和Leigh綜合征[10-11]。mtND5基因的一些突變會(huì)影響復(fù)合體I的酶活性，其中文獻(xiàn)[12]報(bào)道，mtND5 m.12338T＞C突變可能與Leber遺傳性視神經(jīng)病變相關(guān)。Liu等[13]在對(duì)mtND5與母系遺傳性肥厚性心肌病的研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，mtND5 m. 12338 T＞C與母系遺傳肥厚性心肌病的發(fā)生也有一定的相關(guān)性，是肥厚性心肌病的危險(xiǎn)因素之一。Chamkha等[14]在對(duì)嬰幼兒Pompe病研究時(shí)，在mtND5基因上也發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的突變位點(diǎn)，如m.12908 T＞A。但是在弱精子癥中mtND5基因突變尚鮮見報(bào)道。

我們對(duì)m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A三個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)精子活動(dòng)力進(jìn)行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，精子活力a級(jí)與a+b級(jí)百分率在突變組中均顯著低于非突變組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明這三個(gè)位點(diǎn)突變對(duì)精子活力可能有一定作用。再對(duì)這三個(gè)位點(diǎn)突變前后的氨基酸變化情況分析發(fā)現(xiàn)，m.12358 A＞G（Thr→Ala）突變使編碼的極性親水性氨基酸（蘇氨酸）變?yōu)榉菢O性疏水性氨基酸（丙氨酸），這種氨基酸性質(zhì)的改變可能影響蛋白質(zhì)空間構(gòu)象從而影響其功能，再結(jié)合該位點(diǎn)突變在弱精子癥組高于對(duì)照組，我們推測m.12358 A＞G突變可能影響線粒體的功能，影響精子活力。m.12338T＞C突變位于mtND5基因的起始密碼子，當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，使編碼蛋氨酸的起始密碼子變?yōu)榫幋a蘇氨酸的非起始密碼子。由于起始密碼子的突變，理論上推測可能使多肽鏈的翻譯受阻，從而使精子線粒體功能異常，進(jìn)而影響精子活力。然而在我們的實(shí)驗(yàn)中觀察到在對(duì)照組中也存在m.12338 T＞C突變，由于弱精子癥與對(duì)照組精子活力只是數(shù)量上的差異，對(duì)照組個(gè)體精液中也存在一定比例的不活動(dòng)或活動(dòng)力差的精子，對(duì)照組中我們檢測到的m.12338 T＞C突變的3例標(biāo)本c+d級(jí)精子百分率分別為51.5%、49.3%和36.6%，這可能是對(duì)照組中出現(xiàn)m.12338 T＞C突變的原因，有待于進(jìn)一步的研究。

在弱精子癥組中，mtND5 m.12338 T＞C、m. 12358 A＞G和m.12406 G＞A三個(gè)位點(diǎn)突變率高于對(duì)照組，這從另一方面支持這三個(gè)突變對(duì)精子活動(dòng)力的影響，但突變率在兩組間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因之一我們推測這3個(gè)突變位點(diǎn)可能對(duì)精子活力的影響較小，僅僅是一種量的作用，但是不是產(chǎn)生弱精子癥的特異性原發(fā)致病突變位點(diǎn)，有待于進(jìn)一步的研究；原因之二可能是檢測的病例數(shù)偏少，有待擴(kuò)大樣本量做進(jìn)一步的分析。

根據(jù)以上分析，我們認(rèn)為m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A可能與精子活力有一定的相關(guān)性，但是不是弱精子癥的特異性原發(fā)致病突變有待于進(jìn)一步的研究。

[1]Qin Y, Han X, Peng Y, et al. Genetic variants in epoxide hydrolases modify the risk of oligozoospermia and asthenospermia in Han-Chinese population[J]. Gene, 2012, 510(2): 171-174.

[2]Hirsh A. Male subfertility[J]. BMJ, 2003, 327(7416): 669-672.

[3]王懷鵬, 蒲小勇. 弱精子癥的病因[J]. 醫(yī)學(xué)新知雜志, 2008, 18 (1): 16-17.

[4]金龍金, 李傳連, 費(fèi)前進(jìn), 等. mtATPase6基因變異與弱精子癥的相關(guān)性分析[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志, 2008, 30(5): 660-666.

[5]鄭九嘉, 黃學(xué)鋒, 楊宗, 等. mtND2基因多態(tài)性與弱精子癥的相關(guān)性分析[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 32(4): 546-554.

[6]李傳連, 樓哲豐, 黃學(xué)鋒, 等. 線粒體基因ND3、ND4L核苷酸變異與弱精子癥相關(guān)分析[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26 (2): 362-367.

[7]Rieder MJ, Taylor SL, Tobe VO, et al. Automating the identification of DNA variations using quality-based fluorescence re-sequencing: analysis of the human mitochondrial genome [J]. Nucleic Acids Res, 1998, 26 (4): 967-973.

[8]Hofhaus G, Attardi G. Efficient selection and characterization of mutants of a human cell line which are defective in mitochondrial DNA-encoded subunits of respiratory NADH dehydrogenase[J]. Mol Cell Biol, 1995, 15(2): 964-974.

[9]Mitchell AL, Elson JL, Howell N, et al. Sequence variation in mitochondrial complex I genes: mutation or polymorphism?[J]. J Med Genet, 2006, 43(2): 175-179.

[10]Shanske S, Coku J, Lu J, et al. The G13513A mutation in the ND5 gene of mitochondrial DNA as a common cause of MELAS or Leigh Syndrome: evidence from 12 cases[J]. Arch Neurol, 2008, 65(3): 368-372.

[11]Naini AB, Lu J, Kaufmann P, et al. Novel mitochondrial DNA ND5 mutation in a patient with clinical features of MELAS and MERRF[J]. Arch Neurol, 2005, 62(3): 473-476.

[12]Liu XL, Zhou X, Zhou J, et al. Leber's hereditary optic neuropathy is associated with the T12338C mutation in mitochondrial ND5 Gene in six Han Chinese families[J]. Ophthalmol, 2011, 118(5): 978-985.

[13]Liu Z, Song Y, Gu S, et al. Mitochondrial ND5 12338T>C variant is associated with maternally inherited hypertrophic cardiomyopathy in a Chinese pedigree[J]. Gene, 2012, 506 (2): 339-343.

[14]Chamkha I, Alila-Fersi O, Mkaouar-Rebai E, et al. A novel m.12908T>A mutant in the mitochondrial ND5 gene in patient with infantile-onset Pompe disease[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012, 429(1-2): 31-38.

（本文編輯：吳健敏）

Correlative analysis of asthenospermia and the mutation site of 12338, 12358 and 12406 in mtND5

LUO Huiying1, LI Chuanlian2, LOU Zhefeng1, ZHENG Jiujia3, ZHANG Liya3, JIN Longjin1.1.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Clinical Laboratory, Loudi Central Hospital of Hu’nan, Loudi, 417000; 3.Reproductive Medicine Center, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the correlation between asthenospermia and the mutation site of 12338, 12358 and 12406 in mtND5.Methods:Fifty-five semen samples from patients with asthenospermia and 33 from healthy donors based on WHO criteria were collected and analyzed, mutation frequency of 12338, 12358 and 12406 in mtND5 was examined by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing.Results:The mutation frequency (m.12338 T>C 10.9%, m.12358 A>G 9.09%, m.12406G>A 12.7%, total 32.73%) in asthenospermia group was higher than the frequency in control group (9.09%, 3.03%, 3.03% and 15.15%), but there was no significant difference between them (P>0.05). However, the percentages of grade a (20.63±13.63) and grade (a+b) (29.66±17.08) sperm in mutation samples (with m.12338 T>C or m.12358 A>G or m.12406 G>A) were significantly lower than that in non-mutation samples (30.61±18.87 and 41.44±22.47) (P<0.05).Conclusion:These mutations of m.12338 T>C, m.12358 A>G and m.12406 G>A in human sperm may have some correlation with sperm motility, but may not be the specific mutation site of asthenospermia.

asthenospermia; sperm motility; mtND5; mutation

R394.3

A

1000-2138（2014）03-0169-04

2013-11-26

浙江省教育廳科研基金資助項(xiàng)目（Y201223693）；溫州市科技合作項(xiàng)目（H20090063）。

駱慧盈（1988-），女，河南濮陽人，碩士生。

金龍金，教授，Email：1304071636@qq.com。