吳文治，徐英，吳金明，張歡

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

HBV S-ecdCD40L治療性疫苗對乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠肝臟中樹突狀細(xì)胞表型和功能的影響

吳文治，徐英，吳金明，張歡

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325015）

目的：檢測HBV S-ecdCD40L表達(dá)對乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠樹突狀細(xì)胞（DC）成熟分化和功能的影響及其可能機(jī)制。方法：乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠分別肌肉注射質(zhì)粒pcDNA3.1-S-ecdCD40L、pcDNA3.1-S、pcDNA3.1或PBS，每只100 μg/25 g，2、4周后各加強(qiáng)免疫一次。首次免疫6周后，取血，分離DC，檢測細(xì)胞表型及功能，并用熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA含量。結(jié)果：注射pcDNA3.1-S-ecdCD40L小鼠DC中CD80、CD86、MHC II及Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)，白介素-12（IL-12）的分泌及刺激淋巴細(xì)胞的能力均高于其余組小鼠，而平均血清HBV DNA含量明顯低于其余組小鼠。結(jié)論：pcDNA3.1-S-ecdCD40L重組表達(dá)載體介導(dǎo)的HBV S-ecdCD40L表達(dá)能有效地促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小鼠的DC成熟分化和功能提高，激活DC中的TLR4可能是其機(jī)制之一。

乙型肝炎病毒；樹突狀細(xì)胞；Toll樣受體；小鼠

雖然安全有效的乙肝疫苗被各國列入嬰兒常規(guī)免疫近20年，但乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是全球關(guān)注的健康問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前全世界至少有4億人感染HBV，其中我國就有1.2億感染者，且每年有超過100萬的患者死于HBV相關(guān)的肝病，如肝硬化、肝癌等。因此控制HBV的復(fù)制，緩解肝組織活動(dòng)性病變?nèi)允轻t(yī)學(xué)界需要長期努力攻克的堡壘。本實(shí)驗(yàn)采用HBV轉(zhuǎn)基因小鼠代替慢性乙肝患者，通過對照比較檢測疫苗pcDNA3.1-S-ecdCD40L介導(dǎo)的HBV S-ecdCD40L表達(dá)能否有效刺激轉(zhuǎn)基因小鼠樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）成熟及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 動(dòng)物：HBV轉(zhuǎn)基因小鼠購自解放軍第458醫(yī)院全軍肝病中心，該小鼠為高表達(dá)復(fù)制型1.3拷貝HBV全基因轉(zhuǎn)基因小鼠。

1.1.2 疫苗：pcDNA3.1-S-ecdCD40L重組表達(dá)載體[1]、pcDNA3.1-S載體均來自本室前期構(gòu)建。

1.1.3 試劑：HBV DNA定量試劑盒購自深圳匹基公司；CDllc microbead、磁柱均購自Miltenyi Biotec公司；PE/FITC標(biāo)記的CD80、CD86、MHC I I及Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）均購自Ebioscience公司；IL-12p70酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自RD公司；CCK-8購自日本同仁公司；膠原酶IV購自Sigma公司。

1.2 免疫轉(zhuǎn)基因小鼠稱重后，隨機(jī)分為四組，分別肌肉注射pcDNA3.1-S-ecdCD40L（pcDNA3.1-S-ecd CD40L組）、pcDNA3.1-S（pcDNA3.1-S組）、pcDNA3.1（pcDNA3.1組）或PBS（PBS組），每只100 μg/25 g，首次免疫2周和4周后各加強(qiáng)免疫1次，每次100 μg/25 g。首次免疫6周后，處理小鼠。

1.3 肝臟微環(huán)境DC分離培養(yǎng)參照Lu等[2]分離肝臟DC的方法并作一些改進(jìn)。HBV轉(zhuǎn)基因小鼠戊巴比妥腹腔麻醉，無菌開腹，1 mL注射器針頭門靜脈注射20 mL含EGTA 0.19 g/L D-Hanks液，肝臟變白后，下腔靜脈注射5 mL 0.5%膠原酶IV，取肝臟，剪碎后，放入0.5%膠原酶中繼續(xù)消化，37 ℃，30 min。尼龍網(wǎng)過濾，PBS清洗，稀釋成4～5 mL細(xì)胞懸液，percoll密度梯度離心后吸取兩液體界面的非肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，PBS清洗2次。免疫磁珠法分離肝臟DC（按免疫磁珠說明書操作）。按每l×107個(gè)細(xì)胞用80:l磁珠分離液重懸細(xì)胞并加入20 μL CDllc+磁珠的比例操作，4 ℃孵育15 min，經(jīng)細(xì)胞磁性分離系統(tǒng)陽性分選CDllc陽性細(xì)胞，用含lO%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105個(gè)/mL。

1.4 外周血淋巴細(xì)胞分離培養(yǎng)稀釋后血液與淋巴細(xì)胞分離液1:1，2 000 r/min，密度梯度離心20 min后，吸取白膜層，加15%血清完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，隔天取不貼壁細(xì)胞，即為淋巴細(xì)胞。

1.5 DC表型和功能鑒定

1.5.1 DC表型及TLR4表達(dá)檢測：取EP管，每管加100μ L DC懸浮液，分別加入PE-CD86、FITC-CD80、PE-MHC I I、PE-TLR4及同型各5μ L，室溫避光20 min，PBS洗1次，加150 μL 1%多聚甲醛固定，4 ℃保存，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型。

1.5.2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：分離培養(yǎng)小鼠T淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，DC作為刺激細(xì)胞，DC/T比值為1:5、1:10、1:20 等，另設(shè)只含淋巴細(xì)胞的孔為對照組，含RPMI 1640的孔為本底組。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔各加入CCK-8 20μL，繼續(xù)孵育4 h，振蕩混勻后，于參比波長630 nm、檢測波長450 nm處檢測吸光度（A值）。刺激指數(shù)（SI）=（A實(shí)驗(yàn)組-A本底組）/（A對照組-A本底組）。

1.5.3 細(xì)胞因子檢測：收集混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)培養(yǎng)96 h上清液，采用ELISA法檢測IL-12，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的檢測結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，酶標(biāo)儀檢測出樣品的A值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算出對應(yīng)細(xì)胞因子的含量。

1.5.4 血清HBV DNA熒光定量檢測：樣本處理及定量PCR檢測按深圳匹基公司HBV熒光PCR試劑盒操作流程進(jìn)行。分別取0、3、6周的小鼠，眼眶后靜脈叢采血，每次0.3 mL左右，37 ℃恒溫箱孵育30 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上層血清各50μL，加入50μL DNA提取液1，振蕩混勻，10 000 r/min離心10 min，棄上清，再加入12.5 μ L DNA提取液2，振蕩混勻，2 000 r/min離心10 s。100 ℃沸水浴10 min，13 000 r/min離心10 min，取上清2μ L進(jìn)行PCR檢測。由電腦軟件分析計(jì)算給出HBV DNA初始拷貝數(shù)定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以±s表示。采用單因素方差分析法比較各組間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC表型及TLR4表達(dá)檢測pcDNA3.1-S-ecdCD40L組CD80、CD86、MHC I I表達(dá)分別為61.36 ±5.95、60.61±5.25、77.71±3.09，較pcDNA3.1-S組、pcDNA3.1組和PBS組均顯著增高（均P＜0.05），見圖1。pcDNA3.1-S-ecdCD40L組、pcDNA3.1-S組、pcDNA3.1組和PBS組的TLR4表達(dá)分別為（40.88± 8.79）%、（35.35±7.41）%、（29.30±3.64）%和（28.93±3.18）%，pcDNA3.1-S-ecdCD40L組與pcDNA3.1組、PBS組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖1 各組DC表面CD80、CD86和MHC I I表達(dá)

2.2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)pcDNA3.1-S-ecdCD40L組SI最高，DC/T比值為1:5時(shí)，SI=3.00±0.32；DC/ T比值為1:10時(shí)，SI=2.49±0.31；DC/T比值為1: 20時(shí)，SI=1.63±0.24。當(dāng)DC/T比值為1:5及1: 10時(shí)，pcDNA3.1-S-ecdCD40L組SI與另外三組相比有明顯提高（均P＜0.05）；當(dāng)DC/T比值為1:20時(shí)，pcDNA3.1-S-ecdCD40L組SI與其他三組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明該組DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)，且DC/T的比值越大，DC的刺激能力越強(qiáng)。見圖2。

圖2 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)

2.3 細(xì)胞因子檢測pcDNA3.1-S-ecdCD40L組上清液中IL-12p70含量為（107.16±19.09）pg/mL，pcDNA3.1-S組、pcDNA3.1組和PBS組分別為（72.23 ±23.60）pg/mL、（23.89±4.68）pg/mL和（23.19 ±4.21）pg/mL， pcDNA3.1-S-ecdCD40L組IL-12p70含量明顯高于其余三組（均P＜0.05）。

圖3 乙肝轉(zhuǎn)基因小鼠HBV DNA熒光定量檢測

2.4 血清HBV DNA熒光定量檢測免疫治療6周后，pcDNA3.1-S-ecdCD40L組小鼠平均血清HBV DNA拷貝數(shù)明顯低于其他三組。見圖3。

3 討論

HBV感染的徹底控制和清除有賴于機(jī)體的免疫系統(tǒng)。DC作為體內(nèi)作用最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，在HBV感染控制中起到重要作用。研究認(rèn)為HBV可能通過影響DC分化和成熟，進(jìn)而影響輔助T細(xì)胞的分化，導(dǎo)致Th1/Th2失衡，致使特異性細(xì)胞免疫功能降低，HBV感染得以慢性化[3]。所以DC分化成熟是治療HBV感染的關(guān)鍵。

我們的前期體外試驗(yàn)證明，pcDNA3.1-S-ecdCD40L成功轉(zhuǎn)染的DC表型及刺激淋巴細(xì)胞增殖的能力有很大的提高[4]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該治療性疫苗能否在活體內(nèi)取得同樣的效果，我們采用轉(zhuǎn)基因小鼠代替慢性乙肝患者進(jìn)行檢驗(yàn)。通過與另外三組對比，由pcDNA3.1-S-ecdCD40L介導(dǎo)的HBV S-ecdCD40L表達(dá)能有效刺激轉(zhuǎn)基因小鼠DC成熟，細(xì)胞表面抗原CD80、CD86、MHC I I表達(dá)提高，細(xì)胞因子IL-12分泌增多，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)顯示經(jīng)HBV S-ecdCD40L誘導(dǎo)的DC刺激T淋巴細(xì)胞增殖能力提高。

有研究[5]表明，TLR4識別配體后，可通過髓樣分化因子 88（MyD88）依賴和非依賴兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，激活NF-κ B和MAPK，引起多種細(xì)胞因子的釋放，上調(diào)DC表面CD80、CD86等共刺激分子，并最終激活特異性免疫系統(tǒng)。我們在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)PBS組的TLR4表達(dá)較低，經(jīng)pcDNA3.1-S-ecdCD40L刺激后DC表面TLR4的表達(dá)較pcDNA3.1組和PBS組顯著增多，提示該疫苗可增加TLR4表達(dá)，從而促使機(jī)體清除病毒。推測TLR4很可能在HBV轉(zhuǎn)基因小鼠DC成熟中起到重要作用，這有待以后更加深入的研究。

總之，由pcDNA3.1-S-ecdCD40L介導(dǎo)的HBV S-

ecdCD40L表達(dá)能有效促進(jìn)HBV轉(zhuǎn)基因小鼠DC成熟，在將來可能成為治療HBV感染的新方法。

[1]林賢凡, 吳金明, 陳瑾, 等. 乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的設(shè)計(jì)和生物活性預(yù)測[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 39 (3): 205-208.

[2]Lu L, Woo J, Rao AS, et al. Propagation of dendritic cell progenitors from normal mouse liver using granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and their maturational development in the presence of type-1 collagen[J]. J Exp Med, 1994, 179(6): 1823-1834.

[3]王少林, 林玉梅, 馬衛(wèi)閩, 等. HBcAg/HBeAg對慢性乙型肝炎患者PBMC中Th1/Th2類細(xì)胞應(yīng)答的影響[J]. 免疫學(xué)雜志, 2000, 16(6): 451-453.

[4]Wu JM, Lin XF, Huang ZM, et al. Construction of the HBV S-ecdCD40L fusion gene and effects of HBV S-ecdCD40L modication on function of dendritic cells[J]. J Viral Hepat, 2011, 18(10): 461-467.

[5]Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signaling[J]. Nat Rev Immunol, 2004, 7(4): 499-511.

（本文編輯：丁敏嬌）

Effects of HBV S-ecdCD40L on phenotype and function of dendritic cells from hepatitis B virus genome transgenic mouse

WU Wenzhi, XU Ying, WU Jinming, ZHANG Huan.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To examine the influence of expression of HBV S-ecdCD40L on the maturity differentiation and function of the dendritic cells (DC) from hepatitis B virus (HBV) genome transgenic mouse models, and to explain the possible mechanism.Methods:HBV transgenic mice were injected with pcDNA3.1-S-ecdCD40L, pcDNA3.1-S, pcDNA3.1 and PBS respectively, (each 100 μg/25 g). Vaccination was performed on, day 15 and day 30. Six weeks after first injection sera were collected. Isolate DC and examine the phenotypic and functional changes, and the HBV DNA copies in HBV transgenic mice serum were detected by real-time PCR.Results:Compared with other three control groups, DC from injection with pcDNA3.1-S-ecdCD40L mice enhanced expression of costimulatory molecules (CD80, CD86, MHC II), Tollrike receptor 4 (TLR4), proinflammatory cytokine (IL-12p70) and also the capacity to induce allogeneic lymphocytes proliferation. And the average copies of serum HBV DNA were lower than those of the other three control groups. Conclution: The study in vivo supports the concept that the recombinant plasmids pcDNA 3.1-S-ecdCD40L-mediated HBV S-ecdCD40L expression may be a useful strategy for activating DC’s maturity and enhancing its functions.

hepatitis B virus; dendritic cell; Toll like receptor; mice

R512.6

A

1000-2138（2014）04-0248-04

2013-02-25

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2110768，Y12H 030023）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20100204）。

吳文治（1977-），男，湖北武漢人，主治醫(yī)師，碩士。

吳金明，教授，主任醫(yī)師，Email：wujm0516@ yahoo.com.cn。