方海琴，李利忠，趙增明，何 俊，趙 君，楊 嶸，耿 雪，彭雙清

（1．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制研究所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071；2．國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

T-2毒素對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞線粒體功能的抑制作用

方海琴1，2，李利忠1，趙增明1，何 俊1，趙 君1，楊 嶸1，耿 雪2，彭雙清1

（1．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)防控制研究所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心，北京 100071；2．國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021）

目的觀察T-2毒素對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞（m ESC）線粒體功能的毒性作用，探討其胚胎毒性的可能作用靶點(diǎn)與作用機(jī)制。方法處于分化過(guò)程中的m ESC加入T-2 0．5μg·L－1分別作用24，72及120 h，同時(shí)設(shè)Trolox 200μmol·L－1預(yù)處理后30 m in再加入T-2毒素0．5μg·L－1染毒72 h組。透射電子顯微鏡觀察線粒體內(nèi)結(jié)構(gòu)；羅丹明123熒光探針?lè)魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)mESC內(nèi)線粒體膜電位，氧電極法檢測(cè)線粒體呼吸速率，計(jì)算呼吸控制比，熒光素-熒光素酶發(fā)光法測(cè)定ATP合成酶活性。結(jié)果透射電鏡觀察可見(jiàn)，T-2 0．5μg·L－1作用72與120 h組m ESC內(nèi)線粒體數(shù)量明顯減少，結(jié)構(gòu)變形，線粒體中少見(jiàn)或缺少完整的嵴，與正常對(duì)照組相比，mESC內(nèi)線粒體呼吸控制比分別下降49．5%和55．1%（P＜0．05），ATP合成酶活性分別下降84．9%和89．3%（P＜0．05），m ESC線粒體膜電位下降23．2%和35．2%（P＜0．05）。Trolox預(yù)處理可以改善T-2毒素對(duì)上述線粒體功能指標(biāo)的抑制作用。結(jié)論T-2毒素可降低m ESC的線粒體功能，進(jìn)而抑制m ESC的分化能力，可能是其胚胎發(fā)育毒性的作用機(jī)制之一。

T-2毒素；毒性作用；胚胎干細(xì)胞；線粒體；細(xì)胞分化

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．018

T-2毒素是一種由三線鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素，廣泛分布于自然界，尤其對(duì)糧谷作物的污染范圍廣程度重。經(jīng)食物連續(xù)攝入T-2毒素會(huì)對(duì)人類和動(dòng)物的健康造成嚴(yán)重危害，表現(xiàn)出對(duì)生殖發(fā)育系統(tǒng)的母體毒性和胎仔毒性，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，甚至死亡［1－2］。

胚胎干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（embryonic stem cell test，EST）作為歐洲替代方法驗(yàn)證中心（European Centre for the Va lidation o f Alternative Methods，ECVAM）正式批準(zhǔn)為體外發(fā)育毒性篩選的動(dòng)物替代方法，EST可以從細(xì)胞毒性、分化抑制以及分子生物學(xué)水平反映發(fā)育毒性，其中受試物對(duì)ESC向心肌細(xì)胞分化的半數(shù)抑制濃度ID50可反映受試物對(duì)胚胎干細(xì)胞（em bryonic stem ce ll，ESC）分化過(guò)程的影響［3－5］，本課題前期應(yīng)用EST評(píng)價(jià)T-2毒素為強(qiáng)發(fā)育毒性化合物，并得出T-2毒素對(duì)ESC的半數(shù)抑制濃度為0．57μg·L－1［6］。

ESC在分化過(guò)程中，氧耗與供能方式發(fā)生改變，即從糖酵解向需氧代謝轉(zhuǎn)換，因此，線粒體的功能對(duì)于ESC的分化能力發(fā)揮重要作用。已有報(bào)道，在ESC自發(fā)分化為多種細(xì)胞的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)線粒體DNA的含量和分化的相關(guān)性，線粒體DNA數(shù)量隨著干細(xì)胞分化程度的增加而增加，線粒體數(shù)目和形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化［7－9］；以及過(guò)氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α和活性氧（reactive oxygen species，ROS）對(duì)線粒體的調(diào)控在ESC向心肌細(xì)胞的分化，線粒體功能在多能干細(xì)胞和細(xì)胞重編程中皆發(fā)揮著重要的作用［10－11］。

本研究將通過(guò)建立ESC分化模型來(lái)作為胚胎毒性測(cè)試體外替代模型，從細(xì)胞和分子機(jī)制來(lái)探討T-2毒素發(fā)育毒性作用機(jī)制，重點(diǎn)關(guān)注T-2毒素在抑制分化作用濃度下對(duì)小鼠ESC線粒體功能的影響。

1 材料與方法

1．1 細(xì)胞、試劑和主要儀器

小鼠ESC-D3細(xì)胞（murine embryonic stem cell，mESC）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所。T-2毒素由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院疾病預(yù)控制研究所毒理學(xué)評(píng)價(jià)研究中心提供。knockout-DMEM培養(yǎng)基（Du lbecco′s modified Eagle medium）、高糖DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），β-巰基乙醇、非必需氨基酸（NEAA）、N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES）、L-谷氨酰胺，青鏈霉素雙抗和Trizol均購(gòu)自德國(guó)Invitrogen Gibco公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）、二甲亞砜（DMSO）和明膠購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。小鼠白血病抑制因子（murine leukem ia inhibitory factor，m LIF）購(gòu)自美國(guó)Chem icon公司。BCA法蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自北京普利來(lái)生物公司。2′，7′-二氯熒光素〔2′，7′-dichlorofluorescineiacetate（H2-DCFDA）〕、羅丹明123、ADP、地高辛、蘋(píng)果酸、谷氨酸均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，ATP合成酶活力試劑盒（PROMEGA ENLITEN?Total ATP Rapid Biocontamination Detection Kit）購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

10 mg T-2毒素溶于1 m L DMSO，配成濃度10 g·L－1的母液，每管50μL分裝凍存，用時(shí)按需用培養(yǎng)基倍比稀釋。Tro lox溶解于10 m L超純水配制成濃度2 mmol·L－1儲(chǔ)液，過(guò)濾除菌后4℃保存，染毒時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至200μmo l·L－1。

m ESC培養(yǎng)與分化處理按文獻(xiàn)描述［6，12］，懸滴3 d、轉(zhuǎn)懸浮2 d生成擬胚體（embroynic body，EB），分別在EB貼壁24，72和120 h后加入T-2毒素，作用濃度為0．5μg·L－1。按照處理時(shí)間分組為正常對(duì)照組、T-2毒素給藥24，72和120 h組。此外，按給藥30 m in前Trolox預(yù)處理分為單純Trolox預(yù)處理組、Trolox預(yù)處理后T-2毒素0．5μg·L－1染毒72 h組。

1．3 透射電子顯微鏡觀察分化m ESC內(nèi)線粒體結(jié)構(gòu)

收集細(xì)胞，鋨酸固定，乙醇梯度脫水，環(huán)氧丙烷置換，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，切片，采用PhilipsEM208s型透射電子顯微鏡觀察，攝片。每組細(xì)胞采用3張切片，低倍鏡下進(jìn)行全面細(xì)致的觀察后8000倍放大倍數(shù)下拍照，即在選定的每張切片上隨機(jī)拍攝細(xì)胞內(nèi)照片各5張。

1．4 線粒體膜電位的測(cè)定

收集指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，重懸細(xì)胞后，加入羅丹明123染液10 m g·L－1；37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育30 m in；4℃下800×g離心10 m in，培養(yǎng)基洗細(xì)胞2次，PBS重懸；激發(fā)波長(zhǎng)488～505 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm。以相應(yīng)熒光探針熒光讀數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)即可測(cè)定m ESC線粒體膜電位的相對(duì)強(qiáng)度。

1．5 極譜法［13］測(cè)定線粒體呼吸速率

收集細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞數(shù)量為1×105。反應(yīng)體系3 m L，25℃恒溫，以90%速度攪拌。反應(yīng)介質(zhì)為（mmol·L－1）：KCl130，HEPES 10，EDTA 1，KH2PO42．5，去脂牛血清蛋白1．5 mg，pH 7．4。加入蘋(píng)果酸0．1 mmol·L－1和谷氨酸1 mmol·L－1啟動(dòng)態(tài)4（ST4）呼吸。平穩(wěn)后加入200 nmol ADP啟ST3呼吸速率。ADP耗盡后重又回到ST4。記錄儀記錄耗氧曲線，通過(guò)曲線測(cè)定ST4和ST3呼吸，并計(jì)算出呼吸控制比（respiratory control rate，RCR）（ST3／ST4）。

1．6 線粒體ATP合成酶活性的測(cè)定

收集細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)量為1×105，用線粒體呼吸介質(zhì)重懸，反應(yīng)溫度為25℃，在0．5 m L反應(yīng)體系（mmol·L－1）中含有HEPES 10，EDTA 0．5，磷酸緩沖液5，蘋(píng)果酸6，MgCl22．5，反應(yīng)溫度為25℃，在0．5 m L反應(yīng)體系中含有（mm o l·L－1）HEPES 10，EDT 0．5，磷酸緩沖液5，蘋(píng)果酸6，MgCl22．5，記錄以上體系的發(fā)光強(qiáng)度為本底，加入4μL ADP啟動(dòng)反應(yīng)，記錄發(fā)光強(qiáng)度。在不加細(xì)胞和ADP的平行實(shí)驗(yàn)中，加入ATP 1 nm o l·L－1，記錄發(fā)光強(qiáng)度，標(biāo)定ATP合成量。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 T-2毒素對(duì)m ESC的線粒體結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡顯示（圖1），正常對(duì)照組的m ESC分化后，細(xì)胞內(nèi)線粒體豐富，形態(tài)正常，線粒體內(nèi)可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整的嵴（圖1A）；T-2毒素0．5μg·L－1干預(yù)后，隨時(shí)間變化，線粒體數(shù)量與質(zhì)量發(fā)生改變，T-2毒素0．5μg·L－1作用24 h線粒體數(shù)目未見(jiàn)減少（圖1B），而在72與120 h組，可見(jiàn)線粒體數(shù)目的明顯減少，同時(shí)可見(jiàn)線粒體變形，線粒體中少見(jiàn)或缺乏完整的嵴（圖1C，D），提示T-2毒素0．5μg·L－1的長(zhǎng)期干預(yù)會(huì)抑制線粒體生成的數(shù)量與功能。

2．2 T-2毒素對(duì)m ESC線粒體膜電位的影響

結(jié)果如圖2所示，在T-2毒素作用下，m ESC線粒體膜電位呈時(shí)間依賴性下降，表現(xiàn)為膜電位曲線左移（圖2A1）。T-2毒素0．5μg·L－1分別作用72和120 h，m ESC線粒體膜電位分別下降23．2%和35．2%（圖2A2），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。Trolox預(yù)處理后導(dǎo)致m ESC線粒體膜電位下降減小，膜電位曲線明顯右移（圖B1和B2），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

Fig．1 Effec t o f T-2 tox in on m itochond ria l u ltrastruc tu re o f m u rine em b ryonic stem cells（m ESCs）by transm ission elec trica lm ic roscope．A：norm al control group；B，C and D：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h，respectively．Arrows show m itochondria in differentiated m ESCs．

Fig．2 Effec t o f T-2 tox in on m itochond ria lm em b rane po ten tial（△Ψ）o f m ESCs．A1 and A2：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h；B1 and B2：ESCs were pretreated with Trolox 200μmol·L－1for30 m in，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for 72 h．，n＝3．*P＜0．05，compared with normal controlgroup；＃P＜0．05，com pared w ith Trolox group

2．3 T-2毒素對(duì)m ESC線粒體呼吸速率的影響

結(jié)果如圖3所示，T-2毒素對(duì)m ESC的RCR有顯著影響（圖3A）。T-2毒素作用72與120 h，其RCR值分別下降49．5%與55．1%（P＜0．05）（圖3B）。經(jīng)Tro lox預(yù)處理后m ESC線粒體呼吸控制比仍明顯下降，但與單純T-2毒素作用比較，mESC中線粒體呼吸控制比顯著增加，約增加31%（圖3C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2．4 T-2毒素對(duì)mESC線粒體ATP合成酶活性的影響

結(jié)果如圖4所示，T-2毒素對(duì)mESC線粒體的ATP合成酶活性有顯著的抑制作用。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組都表現(xiàn)出顯著性差異，T-2毒素作用24，72和120 h ATP合成酶活性分別下降25．5%，84．9%和89．3%（圖4A）。經(jīng)Trolox預(yù)處理后mESC線粒體合成酶活性仍明顯下降，但與單純T-2毒素作用比較，m ESC中線粒體合成酶活性顯著增加，約增加2倍（圖4B），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

Fig．3 Effect o f T-2 toxin on respiratory contro l ratio（RCR）o fm itochond ria o fm ESCs．A，B：ESCs were treated w ith T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h．C：ESCs were pretreated w ith Trolox 200μmol·L－1for 30 m in，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for 72 h．Dig：digitonin；M＋G：m alage＋glutate．，n＝3．*P＜0．05，com pared w ith normal control group；＃P＜0．05，compared w ith Trolox group．

Fig．4 Effect o f T-2 toxin on ATP synthesis activity o fm ESCs．A：ESCs were treated with T-2 0．5μg·L－1for 24，72 and 120 h．B：ESCs were pretreated with Trolox 200μmol·L－1for30 min，then exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1for72 h．，n＝3．*P＜0．05，compared with normal controlgroup；＃P＜0．05，com pared w ith Trolox group．

3 討論

ESC分化時(shí)有較高的能量要求，分化過(guò)程中耗氧與供能方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，即從糖酵解供能到有氧氧化的轉(zhuǎn)變，線粒體由一種相對(duì)較低的活動(dòng)狀態(tài)向較高的呼吸功能轉(zhuǎn)化［14－15］。此變化類似于胚胎發(fā)育中的線粒體受到體內(nèi)環(huán)境的影響，線粒體的活性和分布狀況會(huì)隨著胚胎發(fā)育時(shí)期的不同而改變［16－17］。本研究觀察到在未分化ESC中線粒體的數(shù)目以及嵴都較貧乏，而ESC分化時(shí)其發(fā)生急劇變化，表現(xiàn)為嵴豐富，數(shù)目增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致，T-2毒素干預(yù)后，ESC內(nèi)線粒體數(shù)目減少，且形態(tài)異常，線粒體嵴缺少，提示T-2毒素干預(yù)抑制分化的ESC線粒體功能。

Esteban等［18］報(bào)道，線粒體膜電位在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced p luripotent stem ce lls，iPSC）獲得多能性的重編程過(guò)程中發(fā)生了變化。ATP的合成要靠呼吸鏈不斷供給質(zhì)子以維持一個(gè)強(qiáng)大的質(zhì)子電化學(xué)梯度，并經(jīng)線粒體ATP合成酶的作用將能量轉(zhuǎn)換用于合成ATP，ROS可導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜通透性增加，通透性增加將不能維持質(zhì)子電化學(xué)梯度［13，17］。本研究發(fā)現(xiàn)，T-2毒素導(dǎo)致m ESC線粒體功能下降呈時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系，表現(xiàn)為線粒體呼吸速率比下降、膜電位下降及ATP合成酶活性下降。

m ESC分化時(shí)需要線粒體功能增加以適應(yīng)其供能需求與氧耗方式的轉(zhuǎn)變，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)T-2毒素可以致分化m ESC內(nèi)ROS生成增加［6］，推測(cè)在長(zhǎng)時(shí)間的ROS作用下，線粒體呼吸鏈復(fù)合體活力降低，電子傳遞鏈功能下降，電子傳遞受阻，使電子漏增加，電子漏的增加進(jìn)一步導(dǎo)致自由基的增加，線粒體ROS的生成與清除進(jìn)一步失衡；過(guò)量ROS引發(fā)線粒體的自身氧化，線粒體內(nèi)膜的完整性被破壞，進(jìn)而引起線粒體膜電位的改變，膜電位的下降又進(jìn)一步使得ATP生成得到抑制，ATP生成的減少使ESC細(xì)胞能量供應(yīng)降低，進(jìn)而分化所需能量供給不足，最終表現(xiàn)出抑制ESC的分化，同時(shí)也造成線粒體功能降低與氧化損傷的惡性循環(huán)。為了進(jìn)一步證實(shí)T-2毒素對(duì)m ESC線粒體功能影響的作用機(jī)制，本研究選擇自由基清除劑Trolox對(duì)m ESC進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROS的下降導(dǎo)致線粒體功能在一定程度上得到恢復(fù)。由此可見(jiàn)，T-2毒素對(duì)線粒體功能的影響與T-2毒素導(dǎo)致ROS的生成有關(guān)，其對(duì)m ESC線粒體功能的抑制可能是產(chǎn)生發(fā)育毒性的作用機(jī)制之一。

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T-2 toxin inhibits m itochond rial func tion o f d ifferen tiated m u rine em b ryonic stem cells

FANG Hai-qin1，2，LILi-zhong1，ZHAO Zeng-m ing1，HE Jun1，ZHAO Jun1，YANG Rong1，GENG Xue2，PENG Shuang-qing1
（1．Evaluation and Research Center for Toxicology，Institute of Disease Prevention and Control，Academy o f M ilitary Medica l Sciences，Beijing 100071，China；2．Key Laboratory o f Food Sa fety Risk Assessm ent o f Ministry of Hea lth，China Nationa l Center for Food Safety Risk Assessm ent，Beijing 100021，China）

OBJECTlVE To exp lore the possib le m echanism or action targets of T-2 toxin em bryo toxicity by observing the effect of T-2 toxin on m itochondrial function of differentiated murine embryonic stem cells（m ESCs）．METHODS During differentiation at24，72 and 120 h，ESCs were exposed to T-2 toxin 0．5μg·L－1．Meanwhile，m ESCs were pre-treated with antioxidant Trolox（200μmol·L－1）for 30 m in and exposed to T-2 toxin（0．5μg·L－1）for 72 h．The m itochondrial ultrasture of differentiated m ESCs was observed under a transim ission electricalm icroscope（TEM）．The differentiated ESC m itochond ria l function，inc luding respiratory contro l ratio（RCR），ATP synthase activity and m itochondria l m embrane potentia l（MMP），was measured at 144 h a fter differentiation．RESULTS Significant decrease of the m itochondria lnumber，de formation o fm itochond ria lstructure，and lack o f comp lete m itochod rial crestwere observed through TEM in the groups o f T-2 toxin exposed for 72 and 120 h，respectively．Compared with the normal control group，RCR declined by 49．5%and 55．1%，ATP synthase activity decreased by 84．9%and 89．3%，and MMP decreased by 23．2%and 35．2%in T-2 toxin 0．5μg·L－1exposure 72 and 120 h group，respectively．However，the inhibition ofm itochondrial function by T-2 toxin in differentiated m ESCs recovered significantly in the presence of the antioxidant Trolox．CONCLUSlON T-2 toxin induces oxidative stress and inhibitsm ESCsm itochondrial function in differentiated m ESCs，and ROS-induced m itochondria lm a lfunction p lays an im portant ro le in T-2 toxin em bryonic toxicity m echanism．

T-2 toxin；toxic actions；embryonic stem ce lls；m itochond ria l；ce ll differentiation

PENG Shuang-qing，E-mail：pengsq＠hotmail．com，Tel：（010）66948462

R394．1

A

1000-3002（2014）03-0415-06

Foundation item：The project supported by International Cooperation Project from Ministry of Science and Technology of China（2011DFA32190）；National Natural Science Founda tion of China（81172699）；National Natural Science Foundation of China（81302462）；and Natural Science Foundation of Beijing City（7142128）

2014-01-02 接受日期：2014-05-10）

（本文編輯：?jiǎn)?虹）

國(guó)家科技部國(guó)際合作項(xiàng)目（2011DFA32190）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81172699）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81302462）；北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（7142128）

方海琴（1977－），女，博士，助理研究員，主要從事食品毒理學(xué)研究；彭雙清（1962－），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事化學(xué)物安全性評(píng)價(jià)研究。

彭雙清，E-mail：pengsq＠hotm ail．com，Tel：（010）66948462