邱 萍，劉平平，孔德松，李 相，李寰舟，王娟紅，潘蘇華

（南京中醫(yī)藥大學(xué)1．中藥學(xué)一級(jí)學(xué)科，2．藥學(xué)院，江蘇南京 210023；3．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城224005；4．南京市中醫(yī)院科教科，江蘇南京210001）

復(fù)方銀杏制劑對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠的防護(hù)作用及其機(jī)制

邱 萍1，2，劉平平3，孔德松4，李 相1，2，李寰舟1，2，王娟紅1，2，潘蘇華1，2

（南京中醫(yī)藥大學(xué)1．中藥學(xué)一級(jí)學(xué)科，2．藥學(xué)院，江蘇南京 210023；3．鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇鹽城224005；4．南京市中醫(yī)院科教科，江蘇南京210001）

目的探討復(fù)方銀杏葉制劑（CGB）對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 雄性KM小鼠，按照分組分別ig給予CGB 0．125，0．25和0．75 g·kg－1、銀杏葉提取物（GBE）0．125 g·kg－1及聯(lián)苯雙酯（Bif）0．15 g·kg－1，連續(xù)8周，于第4和第8周末分別單次ig 56%白酒0．01和0．016 L·kg－1。測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、線粒體門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（mGOT）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量，HE染色法觀察肝組織病理變化，W estern蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝組織細(xì)胞色素P450（CYP）2E1、核因子相關(guān)因子2（Nrf2）和TNF-α表達(dá)。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組小鼠血清GOT和m GOT活性顯著升高（P＜0．01）；與模型組相比，CGB 0．25和0．75及Bif 0．15 g·kg－1組GOT和mGOT活性顯著降低（P＜0．05，P＜0．01）；各組間血清GPT活性無(wú)顯著性差異。HE染色顯示，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組肝細(xì)胞脂肪空泡和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)顯著改善，且效果優(yōu)于GBE。CGB可顯著增強(qiáng)模型小鼠肝組織Nrf2表達(dá)，量效關(guān)系均呈正相關(guān)（r＝0．942，P＜0．01）；并顯著降低肝組織CYP2E1和TNF-α表達(dá)，量效關(guān)系均呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．987，P＜0．05；r＝－0．940，P＜0．05）；此外，CGB組血清TNF-α水平亦顯著下降（P＜0．05，P＜0．01）。結(jié)論 CGB減輕酒精導(dǎo)致急性肝氧化應(yīng)激損傷，其機(jī)制可能與促進(jìn)肝組織Nrf2表達(dá)、抑制CYP2E1和TNF-α表達(dá)并降低血清TNF-α水平有關(guān)。

復(fù)方銀杏葉制劑；肝損傷；氧化應(yīng)激；細(xì)胞色素P450 2E1；核因子相關(guān)因子2；腫瘤壞死因子α

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．011

酒精性肝?。╝lcoho lic liver disease，ALD）發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，氧化應(yīng)激、腸源性內(nèi)毒素血癥、免疫反應(yīng)、遺傳因素和營(yíng)養(yǎng)不良等多種因素均參與ALD的發(fā)生發(fā)展?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，乙醇代謝不僅產(chǎn)生大量還原型輔酶Ⅰ（reduced nicotinam ide adenine dinucleotide，NADH），增加了呼吸鏈中的電子流，還可激活微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)（m icrosomal ethano l oxidase system，MEOS）和還原型輔酶Ⅱ（nicotinam ide adenine dinuc leotide phosphate，NADPH）氧化酶，三者均可產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［1］。其中，MEOS在乙醇代謝過(guò)程中的催化作用有賴于細(xì)胞色素P450 2E1（cytochrom e P450 2E1，CYP2E1）參與，可使肝內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多，抗氧化物減少，引起肝內(nèi)ATP和谷胱甘肽（glutathione，GSH）耗竭［2］。氧化應(yīng)激還可進(jìn)一步導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，且產(chǎn)物如丙二醛（m alondia ldehyde，MDA）可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體引起相應(yīng)免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子表達(dá)，加重酒精性肝損傷［3］。與此同時(shí)，人體代謝乙醇時(shí)還會(huì)啟動(dòng)一些抗氧化通路來(lái)拮抗氧化應(yīng)激損傷。其中，核因子相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是肝防御氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，可介導(dǎo)體內(nèi)抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，降低乙醇導(dǎo)致的肝毒性［4］。

迄今為止，尚無(wú)治療藥物可根治ALD，研發(fā)安全有效干預(yù)ALD病程的藥物具有重大意義。研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是ALD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而抗氧化及抗炎作用的藥物有望成為臨床治療ALD的潛在藥物。大量研究表明，銀杏葉中銀杏黃酮母核中含有還原性羥基功能基團(tuán)，可直接清除氧自由基、羥自由基和過(guò)氧化氫等，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)及炎癥因子表達(dá)；還可提高抗氧化物GSH水平及氧化型GSH還原酶活性［5－6］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，銀杏葉提取物（Ginkgo biloba extracts，GBE）不僅顯著減輕乙醇引起的體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，改善血漿脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，還可一定程度抑制長(zhǎng)期飲酒所致的肝纖維化。刺梨最早記載于《本草綱目拾遺》，具有健脾消食和滋陰潤(rùn)燥作用?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，刺梨富含維生素C、維生素E、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和刺梨黃酮等。本研究將兩者配伍成復(fù)方銀杏葉制劑（compound Ginkgo biloba，CGB），觀察其是否可產(chǎn)生協(xié)同抗氧化作用，從而減輕乙醇導(dǎo)致的肝氧化應(yīng)激損傷。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑和儀器

清潔級(jí)昆明種健康雄性小鼠，體質(zhì)量18～22 g，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)：SCXK（滬）2007-0005，常規(guī)條件飼養(yǎng)。GBE，邳州鑫源生物制品有限公司提供，其中黃酮苷≥24．0%，銀杏內(nèi)酯≥6．0%；刺梨汁粉，江蘇天江藥業(yè)股份有限公司，維生素C含量≥16 g·L－1；CGB，本室制備，配方已申請(qǐng)專利（專利號(hào)：01108284．4），由銀杏葉提取物26%、刺梨汁粉26%和藥用輔料48%組成，按此比例混合加水配制成不同濃度藥物，本實(shí)驗(yàn)室采用HPLC法測(cè)定總黃酮苷含量≥4．8%，銀杏內(nèi)酯≥1．2%；聯(lián)苯雙酯（bifendate，Bif），批號(hào)：08040103，北京協(xié)和制藥廠；酒精度56%（V／V）紅星二鍋頭白酒，北京紅星股份公司。血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（a lanine am inotransferase，GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate am inotransferase，GOT）和線粒體門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（m itochond ria l aspartate am inotransferase，m GOT）測(cè)定試劑盒，上?？迫A生物工程股份有限公司；小鼠血清腫瘤壞死因子α（tum or necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；30%丙烯酰胺溶液，美國(guó)BioRad公司；BCA蛋白質(zhì)定量檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Pierce公司；磷酸酶抑制劑，上海生工生物工程有限公司；兔抗小鼠CYP2E1、Nrf2、TNF-α和β肌動(dòng)蛋白單抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體，南京Bioworld公司；抗管蛋白抗體，美國(guó)Affinity公司；化學(xué)發(fā)光液，美國(guó)Millipore公司；超純水由M illipore超純水系統(tǒng)制備；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-TEK公司；VITROS 950全自動(dòng)生化分析儀，美國(guó)強(qiáng)生公司；DMLS2光學(xué)顯微鏡，德國(guó)LEICA公司；AnkeTDL-40B離心機(jī)，上海安壽科學(xué)儀器廠；Mettler Toledo AL-104電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；CXHF-D高速內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；凝膠成像系統(tǒng)垂直電泳，蛋白轉(zhuǎn)印裝置，凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司；MSD97K49微量離心機(jī)，高速冷凍離心機(jī)，Beckm an公司；AF10制冰機(jī)，美國(guó)SCORTSMAN公司；移液器，德國(guó)Eppendorf公司；－80℃冰箱，美國(guó)Thermo公司。

1．2 動(dòng)物分組、處理和樣本制備

健康雄性KM小鼠82只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、CGB 0．125，0．25和0．75 g·kg－1組、GBE 0．125 g·kg－1組及Bif 0．15 g·kg－1組，正常對(duì)照組10只，其余組12只。模型對(duì)照組和正常對(duì)照組ig給予同體積蒸餾水，其余組ig不同劑量藥物，每次1次，連續(xù)8周。第4周末除正常對(duì)照組外余組單次ig白酒0．01 L·kg－1（4．48 g·kg－1），繼續(xù)觀察并記錄體質(zhì)量變化。第8周末，除正常對(duì)照組給蒸餾水外，余組均ig白酒0．016 L·kg－1（6．72 g·kg－1），禁食12 h后眼眶取血，4℃，1200×g離心15 m in制備血清，脫臼處死小鼠，迅速取出肝組織，在左肝葉同一部位，取一小塊肝組織用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，以4%中性甲醛溶液固定，剩余組織－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 組織病理學(xué)觀察

上述肝組織經(jīng)4%中性甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4～5μm，常規(guī)HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理改變，根據(jù)病變程度進(jìn)行評(píng)估積分（表1）并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

Tab．1 Deg ree standard o f hepatocyte fatty degeneration analysis

1．4 血清GPT，GOT和mGOT活性測(cè)定

運(yùn)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中GPT，GOT和mGOT活性。

1．5 血清TNF-α測(cè)定

采用雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作，于全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀450 nm讀取吸光度值，測(cè)定血清中TNF-α含量。

1．6 Western蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)肝組織CYP2E1，Nrf2和TNF-α表達(dá)

稱取肝組織0．05 g，按質(zhì)量／體積比1∶5加入預(yù)冷RIPA裂解液，立即加入PMSF和磷酸酶抑制劑，冰上孵育30 m in，移入離心管4℃，20 000×g離心15 m in取上清液為細(xì)胞裂解液，吸取部分上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。其余加等體積的6×電泳加樣緩沖液，沸水浴10 m in。實(shí)驗(yàn)前1500×g離心10 m in，配制SDS-PAGE凝膠進(jìn)行上樣（上樣量50μg），電泳40 m A 1．5 h，轉(zhuǎn)膜100 V 1．5 h。脫脂奶粉封閉，一抗及二抗孵育，將PVDF膜放入Bio-Rad Chem iDoc XRS＋化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，用凝膠成像系統(tǒng)圖像分析軟件分析各條帶積分吸光度，待測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)水平用待測(cè)蛋白管蛋白條帶與β肌動(dòng)蛋白條帶積分吸光度比值表示。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 CGB對(duì)小鼠一般情況的影響

正常對(duì)照組小鼠實(shí)驗(yàn)期間皮毛光滑，活動(dòng)正常。模型組和各給藥組灌胃白酒后，約2 m in后見(jiàn)四肢癱軟、行走不穩(wěn)或酣睡等醉酒狀態(tài)；灌胃后6 h內(nèi)小鼠皮毛蓬亂，精神萎靡，行動(dòng)遲緩。各給藥組小鼠毛發(fā)光澤度較好，醒酒后活動(dòng)有不同程度增加。

2．2 CGB對(duì)肝損傷小鼠體質(zhì)量變化的影響

由表2所見(jiàn)，各組小鼠給藥前體質(zhì)量無(wú)顯著性差異；第4周末ig白酒0．01 L·kg－1后，小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)有減緩趨勢(shì)；至第8周，模型組小鼠較正常對(duì)照組體質(zhì)量明顯降低（P＜0．01），CGB各劑量組、GBE組和Bif組小鼠體質(zhì)量均明顯增加（P＜0．05，P＜0．01）。

Tab．2 Effec t o f com pound Ginkgo biloba（CGB）on body m ass o fm ice w ith alcoho l-induced liver in ju ry

2．3 CGB對(duì)肝損傷小鼠GPT，GOT和m GOT活性的影響

由表3可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組小鼠血清GPT，GOT和mGOT活性顯著性升高（P＜0．01），CGB各劑量組和Bif組GPT活性無(wú)明顯變化；CGB 0．25和0．75 g·kg－1組及Bif 0．15 g·kg－1組GOT和mGOT活性顯著降低（P＜0．05），GBE 0．125 g·kg－1對(duì)GPT，GOT和mGOT活性無(wú)明顯影響。

Tab．3 Effect o f CGB on activity o f alanine am ino trans ferase（GPT），aspartate am ino trans ferase，（GOT）and m itochond rial aspartate am ino trans ferase（mGOT）o fm ice w ith alcoho l-induced liver in jury

2．4 CGB對(duì)肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響

由圖1和表4所見(jiàn)，正常對(duì)照組肝細(xì)胞索排列較整齊，未見(jiàn)水樣變性及脂肪變性，未見(jiàn)纖維結(jié)締組織增生及假小葉形成，Kup ffer細(xì)胞未見(jiàn)增生，毛細(xì)血管及匯管區(qū)內(nèi)膽管未見(jiàn)膽汁淤積，匯管區(qū)未見(jiàn)纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）。模型組肝組織均可見(jiàn)肝細(xì)胞水樣變性，肝細(xì)胞脂肪變性，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B），與正常對(duì)照組相比，有顯著性差異（P＜0．01）。與模型組比較，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組和Bif 0．15 g·kg－1組（圖1G）肝損傷顯著性減輕（P＜0．01，P＜0．05），少量細(xì)胞存在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肝脂肪變較輕（圖1D和E）。GBE組肝細(xì)胞部分細(xì)胞可見(jiàn)片狀水腫和脂肪變，匯管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1F），但無(wú)顯著性差異，提示CGB效果優(yōu)于單方。

2．5 CGB對(duì)肝損傷小鼠肝組織CYP2E1蛋白表達(dá)的影響

由圖2結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織CYP2E1表達(dá)升高（P＜0．01）；與模型組比較，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組肝組織CYP2E1表達(dá)降低，其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．987，P＜0．05）；Bif0．15 g·kg－1組CYP2E1表達(dá)水平亦顯著性降低（P＜0．05），GBE組無(wú)明顯變化。

Fig．1 Effect o f CGB on livermorpho logical changes o fm ice w ith alcoho l-induced liver in jury（HE staining）．See Tab．2 for the m ouse treatm ent．A：norm al control group；B：m odel group；C，D and E：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively；F：GBE 0．125 g·kg－1group；G：bifendate 0．15 g·kg－1group．The black arrow indicates the fat droplets in the liver sections．The red arrow indicates neutrophil infiltration．

Tab．4 Effec t o f com pound Ginkgo biloba（CGB）on deg ree o f s teatosis o f m ice w ith alcoho l-induced liver in jury

Fig．2 Effect o f CGB on cytoch rome P450（CYP）2E1 p ro tein exp ression in liver tissue o f m ice w ith alcho linduced liver in ju ry by Western b lotting．See Tab．2 for the mouse treatment．1：normal control group；2：model group；3：bifendate 0．15 g·kg－1group；4：GBE 0．125 g·kg－1group；5－7：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively．B was the sem iquantitative result of A．IA：integrated absorbance．，n＝3．**P＜0．01，compared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with modelgroup．

2．6 CGB對(duì)肝損傷小鼠肝組織Nrf2和TNF-α蛋白表達(dá)的影響

Fig．3 Effec t o f CGB on NF-E2-related fac to r 2（Nrf2）and tum o r nec rosis fac to r-α（TNF-α）p ro tein exp ression in liver tissue o f m ice w ith alcoho l-induced liver in jury by Wes tern b lotting．See Tab．2 for the mouse treatment．1：normal control group；2：model group；3：bifendate 0．15 g·kg－1group；4：GBE 0．125 g·kg－1group；5－7：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively．B and C were the sem iquantitative results of A．，n＝3．**P＜0．01，compared w ith normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with modelgroup．

圖3結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組Nrf2表達(dá)無(wú)明顯變化，TNF-α表達(dá)水平明顯升高（P＜0．01）；與模型組比較，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組Nrf2表達(dá)水平明顯增高，其量效關(guān)系呈正相關(guān)（r＝0．942，P＜0．05）；TNF-α表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05，P＜0．01），其量效關(guān)系呈負(fù)相關(guān)（r＝－0．940，P＜0．05）；Bif 0．15 g·kg－1組Nrf2表達(dá)水平明顯增高（P＜0．05），TNF-α表達(dá)水平明顯降低（P＜0．05）；GBE組Nrf2和TNF-α無(wú)明顯變化。

2．7 CGB對(duì)肝損傷小鼠血清TNF-α水平的影響

圖4結(jié)果表明，與正常對(duì)照組比較，模型組血清TNF-α濃度顯著升高（P＜0．01）；CGB 0．25和0．75 g·kg－1和Bif0．15 g·kg－1可明顯降低模型小鼠血清TNF-α水平（P＜0．05，P＜0．01），GBE組無(wú)明顯變化。

Fig．4 Effect o f CGB on serum TNF-αlevel o f m ice w ith liver in jury induced by alcoho l．See Tab．2 for the mouse treatment．1：norm al control group；2：model group；3：bifendate 0．15 g·kg－1group；4：GBE 0．125 g·kg－1group；5－7：CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1group，respectively．，n＝8－12．**P＜0．01，com pared with normal control group；＃P＜0．05，＃＃P＜0．01，compared with modelgroup．

3 討論

以往研究認(rèn)為，乙醇通過(guò)多條途徑導(dǎo)致氧化應(yīng)激并可導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)生物膜脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，促進(jìn)白細(xì)胞游走及趨化作用；損傷肝細(xì)胞線粒體，減少ATP產(chǎn)生，干擾脂肪酸β氧化，減少ATP生成，并導(dǎo)致甘油三酯在肝沉積；亦可通過(guò)調(diào)控線粒體的凋亡信號(hào)分子Bcl-2、Bax和胱天蛋白酶等表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7－8］。Eckert等［9］報(bào)道，GBE可減輕體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷，刺梨中豐富的刺梨黃酮及多糖亦具有抗氧化應(yīng)激和減輕酒精誘導(dǎo)的肝損傷作用［10］。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)第4周末單次ig白酒（56%V／V，0．01 L·kg－1）導(dǎo)致模型對(duì)照組小鼠不能耐受酒精刺激，表現(xiàn)為后期體質(zhì)量嚴(yán)重下降，而CGB各組和Bif組小鼠耐受性較好，體質(zhì)量仍持續(xù)上升。本研究采用酒精急性肝損傷模型，一次大劑量酒精沖擊（56%V／V，0．016 L·kg－1）和禁食聯(lián)合造模，其機(jī)制除與乙醇早期干擾肝脂質(zhì)代謝外，還與禁食引起肝脂肪動(dòng)員有關(guān)，禁食引起糖原含量降低，加速脂肪被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝細(xì)胞進(jìn)行糖異生合成脂肪［11］。本研究結(jié)果可見(jiàn)，與模型組比較，CGB各組GPT活性無(wú)明顯變化，可能與小鼠肝具有較強(qiáng)的自主修復(fù)和代償能力有關(guān)［12］。CGB 0．25和0．75 g·kg－1組與模型組比較，血清GOT和m GOT活性降低，提示CGB可保護(hù)乙醇引起的細(xì)胞膜以及線粒體膜損傷。GOT有2種同工酶，一種存在細(xì)胞漿中，為上清液GOT；另一種存在線粒體內(nèi)，為線粒體GOT。正常血清GOT主要為上清液GOT，當(dāng)肝細(xì)胞內(nèi)線粒體受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)可導(dǎo)致線粒體GOT升高，該指標(biāo)有助于判斷肝損傷的程度及預(yù)后。除此之外，急性酒精中毒后禁食時(shí)間越長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組肝脂肪變性程度與對(duì)照組差異越大，可能與禁食引起肝脂肪動(dòng)員程度有關(guān)［12］。本研究中CGB各組不同程度脂肪變減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和細(xì)胞壞死情況也相應(yīng)減少。

以往研究報(bào)道，CYP2E1與體內(nèi)乙醇代謝密切相關(guān)，肝中大部分CYP2E1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期飲酒后滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)增生；且CYP2E1在中央靜脈周圍肝細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)，這與該處氧化應(yīng)激最活躍及組織供氧不足相一致，為酒精性肝損傷易發(fā)部位。Lu等［13］研究發(fā)現(xiàn)，敲除CYP2E1基因可有效抑制乙醇所致的脂肪肝、酒精性肝炎和肝纖維化。前期研究成果顯示，CGB可通過(guò)提高肝組織GSH和SOD水平，降低MDA水平防治大鼠慢性酒精性肝損傷，并采用“Cocktail”探針?lè)ńY(jié)合高效液相色譜研究發(fā)現(xiàn)，其作用可能與CGB抑制乙醇誘導(dǎo)的CYP2E1酶水平升高而降低氧化應(yīng)激損傷有關(guān)［14］。本研究采用Western蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)一步研究證實(shí)，CGB能夠抑制乙醇刺激后肝組織CYP2E1高表達(dá)，拮抗乙醇代謝過(guò)程的氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。

Nrf2是體內(nèi)抗氧化關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子，可通過(guò)抗氧化應(yīng)激維護(hù)肝功能穩(wěn)定，對(duì)降低乙醇介導(dǎo)的肝毒性及炎癥反應(yīng)均起著重要作用。Nrf2與Keap l解偶聯(lián)后轉(zhuǎn)移入核，與抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，通過(guò)轉(zhuǎn)錄性調(diào)節(jié)編碼脫毒酶和抗氧化蛋白的基因而達(dá)到細(xì)胞保護(hù)作用［15］。本研究結(jié)果表明，模型對(duì)照組Nrf2表達(dá)高于正常對(duì)照組，提示乙醇引起肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)，可能作為肝細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激一種適應(yīng)性保護(hù)反應(yīng)，這與Gong等［16］研究結(jié)果一致。與模型對(duì)照組相比，CGB 0．25和0．75 g·kg－1組Nrf2表達(dá)呈顯著性升高，效果優(yōu)于單方，提示CGB預(yù)處理可誘導(dǎo)飲酒小鼠Nrf2表達(dá)，通過(guò)產(chǎn)生下游相關(guān)抗氧化物酶來(lái)起到減輕急性酒精誘導(dǎo)肝氧化應(yīng)激的作用，可能為銀杏制劑抗氧化保護(hù)肝細(xì)胞的具體機(jī)制之一。

TNF-α是酒精性肝損傷引發(fā)氧化應(yīng)激和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。TNF-α是一非糖基化蛋白，可直接引起肝細(xì)胞脂肪變性、炎癥及肝細(xì)胞壞死；促進(jìn)機(jī)體外周脂肪分解，使游離脂肪酸通過(guò)血液進(jìn)入肝臟并蓄積；還可減少對(duì)離脂肪酸和低密度脂蛋白等消除［17］。Ji等［18］報(bào)道，TNF-α主要通過(guò)與肝細(xì)胞的TNF-R1結(jié)合而導(dǎo)致肝損傷，將TNF-R1基因敲除可阻斷乙醇所致的脂肪肝。此外，TNF-α?xí)ㄟ^(guò)促進(jìn)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白和抑制脂聯(lián)素（adiponectin）基因表達(dá)而導(dǎo)致脂肪合成的增加［19］。TNF-α還可加重線粒體功能障礙，造成線粒體內(nèi)ROS增多和抗氧化物水平進(jìn)一步下降，最終誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡。因此，抑制肝內(nèi)TNF-α表達(dá)可有望減輕TNF-α水平可減輕酒精性肝損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，CGB抑制乙醇引起的TNF-α高表達(dá)，進(jìn)而避免肝細(xì)胞線粒體功能受損，抑制細(xì)胞凋亡，同時(shí)改善肝細(xì)胞脂肪變性和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

綜上所述，CGB對(duì)酒精性急性肝損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與誘導(dǎo)肝組織Nrf2表達(dá)，同時(shí)減少乙醇引發(fā)肝組織CYP2E1和TNF-α高表達(dá)和降低血清TNF-α水平有關(guān)。

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Protec tive effec t o f Com pound Ginkgo against acu te alcoho l-induced liver in ju ry and its m echanism

QIU Ping1，2，LIU Ping-ping3，KONG De-song4，LIXiang1，2，LIHuan-zhou1，2，WANG Juan-hong1，2，PAN Su-hua1，2
（1．Nationa l First-Class Key Discip line for Traditiona l Chinese Medicine，2．Co llege o f Pharm acy，Nan jing University o f Chinese Medicine，Nan jing 210023，China；3．Yancheng Institute o f Health Science，Yancheng 224005，China；4．Nan jing Municipa l Hospital o f TCM，Nan jing 210001，China）

OBJECTlVETo observe the protective effect and mechanism of Compound Ginkgo biloba（CGB）against alcohol-induced liver injury．METHODSMice were given CGB 0．125，0．25 and 0．75 g·kg－1，Ginkgo biloba extract（GBE）0．125 g·kg－1and bifendate（Bif）0．15 g·kg－1for8 weeks，respectively．At the end of 4th week the m ice were given wine by gavage（56%V／V，0．01 L·kg－1），and（56%V／V，0．016 L·kg－1）at the end of the 8 th week．The serum was obtained to m easure a lanine transam inase（GPT），aspartate am inotransam inase（GOT），m itochond rial aspartate am inotransferase（mGOT）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）．Liver histopathology was revealed by HE staining．The p rotein exp ression o f cytochrom e P450（CYP）2E1，NF-E2-re lated factor 2（Nrf2）and TNF-αin the liver was analyzed by Western blotting．RESULTSCompared with normalcontrolgroup，the activities of GOT and m GOT were increased in mode l group（P＜0．01）．Com pared w ith m ode l group，CGB 0．25 and 0．75 g·kg－1groups and Bif 0．15 g·kg－1group significantly decreased the activity of GOT and m GOT in serum（P＜0．05，P＜0．01），while there was no significant difference between these groups in serum GPT activity（P＞0．05）．Fatty degeneration and neutrophil infiltration were significantly ameliorated in CGB 0．25 and 0．75 g·kg－1groups．Pre lim inary mechanism research showed CGB not on ly increased the protein expression of Nrf2 w ith a positive dose-effect relationship（r＝0．942，P＜0．01），but reduced the protein exp ression o f hepatic CYP2E1 and the leve l o f TNF-αin hepatic tissue w ith a negative dose-effect relationship（r＝－0．987，P＜0．05；r＝－0．940，P＜0．05）．In addition．The level of TNF-αwas also significantly decreased in the serum（P＜0．05，P＜0．01）．CONCLUSlONCGB may protect the liver from acute alcoholic injury and the mechanism may be that it increases the protein expression of Nrf2，restrains the protein expression of hepatic CYP2E1 and TNF-αand reduces the TNF-αlevel in the serum．

Ginkgo biloba；liver injury；oxidative stress；cytochrome P450 2E1；NF-E2-related factor 2；tumor necrosis factor-α

PAN Su-hua，E-mail：2641033550＠qq．com，Tel：（025）85811207

R285，R963

1000-3002（2014）03-0373-07

Foundation item：The project supported by Priority Academ ic Program Deve lopment o f Jiangsu Higher Educa tion Institutions（ysxk-2010）

2013-11-28 接受日期：2014-05-26）

（本文編輯：齊春會(huì)）

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（ysxk-2010）

邱 萍（1989－），女，碩士研究生，主要從事天然藥物預(yù)防和治療酒精性肝病研究；潘蘇華（1956－），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事天然藥物預(yù)防和治療酒精性肝病研究。

潘蘇華，Tel：（025）85811207，E-mail：2641033550＠qq．com