左 靖，楊 明，李 淼，杜麗娜，金義光

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽合肥 230032；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥物化學(xué)研究室，北京 100850；3．北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029）

吉西他濱脂質(zhì)衍生物聚合物膠束的制備及其理化性質(zhì)和抗腫瘤活性

左 靖1，2，楊 明3，李 淼2，杜麗娜2，金義光1，2

（1．安徽醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院，安徽合肥 230032；2．軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所藥物化學(xué)研究室，北京 100850；3．北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100029）

目的制備吉西他濱（Gem）脂質(zhì)衍生物及其聚合物膠束，克服Gem體內(nèi)易失活、不能口服和無靶向性的缺陷。方法合成N-苯甲酰-3′-乙酰吉西他濱（BAG）。用注入法制備載BAG的泊洛沙姆188膠束（BAG∶泊洛沙姆188＝10∶1，mol／mol）；用激光粒度和電位儀測定膠束的粒度和Zeta電位；膠束用負(fù)染法透射電鏡法觀察膠束微觀形態(tài)。Gem或BAG聚合物膠束5，10，20，30，50，70和90μmol·L－1與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)24，48和72 h，用MTT法測定對MCF-7細(xì)胞生長的抑制率。肝癌細(xì)胞H22移植瘤小鼠分別iv或ig給予Gem 40 m g·kg－1或BAG聚合物膠束62 m g·kg－1，間隔2 d給藥1次，共3次，末次給藥后第2天處死小鼠，測定抑瘤率。結(jié)果經(jīng)薄層色譜法、核磁共振氫譜和碳譜、紅外光譜和質(zhì)譜驗(yàn)證，BAG的結(jié)構(gòu)正確。BAG聚合物膠束外觀為淡藍(lán)色乳光的透明溶液，粒徑為62．82 nm，Zeta電位為－18．8 m V，電鏡下呈現(xiàn)球狀均勻分布。MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gem和BAG聚合物膠束分別與MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24，48和72 h，其抑制MCF-7細(xì)胞生長的IC50分別為40．6和90．0，5．0和14．9，5．0和13．6μm o l·L－1。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gem口服和注射組與模型對照組比較（P＜0．01）、BAG聚合物膠束口服和注射組與泊洛爾姆188空白膠束組比較（P＜0．05，P＜0．01）均具有明顯的抑瘤作用；作用強(qiáng)度，BAG聚合物膠束口服優(yōu)于Gem口服（P＜0．05），BAG聚合物膠束注射優(yōu)于其口服（P＜0．05），BAG聚合物膠束注射與Gem注射作用相當(dāng)。結(jié)論Gem脂質(zhì)衍生物能載入泊洛沙姆188聚合物膠束內(nèi)。BAG聚合物膠束體外對MCF-7細(xì)胞生長有抑制作用，iv和ig給藥對小鼠H22移植瘤均具有抑瘤作用。BAG聚合物膠束口服優(yōu)于Gem口服，提示BAG聚合物膠束有望開發(fā)成為新型的抗腫瘤口服制劑。

吉西他濱；脂質(zhì)衍生物；聚合物膠束；抗腫瘤藥

DO l：10．3867／j．issn．1000-3002．2014．03．017

目前，抗腫瘤藥物由于缺乏體內(nèi)分布的特異性，在正常組織分布較多，致使毒性作用顯著。腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙大，對生物大分子和納米顆粒的滲透性增強(qiáng)，同時(shí)腫瘤組織淋巴循環(huán)差，使?jié)B透進(jìn)入腫瘤的生物大分子及納米顆粒滯留增強(qiáng)，稱為增強(qiáng)滲透和滯留效應(yīng)，成為腫瘤靶向納米系統(tǒng)設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)［1－2］，如脂質(zhì)體［3－4］、納米粒［5－6］、納米脂質(zhì)載體［7］和聚合物膠束［8－9］等。上市藥物如注射用紫杉醇脂質(zhì)體（力樸素?）、鹽酸多柔比星脂質(zhì)體注射液（格萊?）和注射用紫杉醇白蛋白納米粒（Abraxane?）均具有良好腫瘤靶向治療作用，減小了毒性作用。

核苷類藥物被細(xì)胞攝取后干擾DNA和RNA復(fù)制，使細(xì)胞代謝和增殖周期中斷，廣泛用于抗腫瘤治療。吉西他濱（gem citabine，Gem）是一線核苷類抗腫瘤藥，臨床上用于治療胰腺癌和乳腺癌等多種惡性腫瘤［10］。Gem進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)脫氧胞嘧啶核苷激酶磷酸化，轉(zhuǎn)化成具有活性的二磷酸核苷及三磷酸核苷發(fā)揮抗腫瘤作用。體內(nèi)普遍存在的胞嘧啶核苷脫氨酶能將Gem迅速脫氨基化而失活。因此，減少或避免脫氨基化成為Gem衍生化研究的熱點(diǎn)［11］。本研究合成了Gem 脂質(zhì)衍生物 N-苯甲酰-3′-乙酰吉西他濱（N-benzoy-3′-acetylgem citabine，BAG），制備載BAG的泊洛沙姆188（P188）膠束，測定其粒徑、表面電位及載藥量，評價(jià)其體內(nèi)外抗腫瘤作用。

1 材料與方法

1．1 藥物、試劑和儀器

Gem，C9H11F2N3O4，純度99．6%，北京凱萊森醫(yī)藥科技有限公司，批號20110203，臨用前用生理鹽水溶解；苯甲酸酐、叔丁基二甲基氯硅烷、咪唑和三水合四丁基氟化銨（TBAF·3H2O）均購自北京偶合科技有限公司；乙酸酐，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙酸（含量≥99．5%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；P188，德國巴斯夫公司；除HPLC分析所用試劑為色譜純外，其余試劑均為分析純；反應(yīng)溶劑均經(jīng)脫水處理。JNM-ECA-400型超導(dǎo)核磁共振儀，日本電子株式會(huì)社；LCQ Max型質(zhì)譜儀，美國Finnigan公司；H-7650型透射電鏡，AMT cam era system，80 kV，日本Hitachi公司；Zetasizer Nano ZS型激光粒度和電位儀，英國Malvern公司；MinitroughⅡ型Langmuir膜天平，芬蘭KSV公司；L-2310型高效液相色譜儀，日本Hitachi公司；VenusilMP C18柱（5μm，250 mm×4．6 mm），天津博納艾杰爾科技有限公司。

1．2 細(xì)胞和動(dòng)物

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞來自北京化工大學(xué)。SPF級昆明小鼠45只，20～24 g，雄性，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號：SCXK（京）2012-0001。

1．3 吉西他濱脂質(zhì)衍生化

Gem脂質(zhì)衍生化主要在酰胺鍵和糖環(huán)上4位羥基進(jìn)行脂質(zhì)化，合成步驟參考阿糖胞苷衍生化路線［12］。具體反應(yīng)過程如下：稱取Gem 0．2638 g（1 mmol）溶于50 m L乙醇，80℃攪拌回流5 m in，加苯甲酸酐0．2728 g（1．2 mm o l）繼續(xù)反應(yīng)1 h，以后每小時(shí)加入苯甲酸酐1．2 mm ol，共加3次，最后1次加入后，繼續(xù)回流反應(yīng)1 h。旋蒸除去溶劑后得粗產(chǎn)物。用二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物后在硅膠柱上分離，收集帶有產(chǎn)物點(diǎn)的洗脫液，除溶劑，得N-苯甲酰-吉西他濱（N-benzoyl gemcitabine，BG）白色粉末，產(chǎn)率71%。取BG 0．1835 g（0．5 mmol）、咪唑0．1126 g（1．6 mm ol）溶于6 m L N，N-二甲基甲酰胺，加入叔丁基二甲基氯硅烷0．1388 g（0．9 mm ol），加干燥管后室溫?cái)嚢?2 h，加入6 m L甲苯共沸，除溶劑，得透明油狀物。用體積分?jǐn)?shù)2%甲醇氯仿溶液溶解油狀物后，在硅膠柱上分離，收集帶有產(chǎn)物點(diǎn)的洗脫液，除溶劑，得N-苯甲酰-4-叔丁基二甲基硅烷吉西他濱（N-benzoyl-4-tert-butyl dimethyl silyl gem citabine，BTG）白色顆粒。BTG 0．2112 g（0．4 mm o l）溶于12 m L無水吡啶，加乙酸酐（5．3 m L）室溫?cái)嚢?4 h，除溶劑，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)2%甲醇氯仿溶液溶解后柱層析純化，得N-苯甲酰-3′-乙酰-4-叔丁基二甲基硅烷吉西他濱（N-benzoyl-3′-acetyl-4-tert-butyl dimethyl silyl gem citabine，BATG）白色糊狀物。取TBAF·3H2O 1．5575 g（5 mmo l）溶于5 m L四氫呋喃。另取BATG 0．1511 g（0．28 mm o l）溶于上述TBAF溶液中，室溫反應(yīng)10 m in后，加入乙酸0．1 m L，繼續(xù)攪拌2 h，除溶劑，得淡黃色油狀物，在硅膠柱上分離，得終產(chǎn)物N-苯甲酰-3′-乙酰吉西他濱（N-benzoy-3′-acetylgem citabine，BAG）白色粉末（圖1）。

1．4 吉西他濱脂質(zhì)衍生物結(jié)構(gòu)鑒定

1．4．1 色譜法

參照《中國藥典》第二部（2010版）附錄V B薄層色譜法，吸取BAG甲醇溶液和Gem水溶液10μL，點(diǎn)于硅膠G薄層板上，以氯仿∶甲醇（9∶1，V／V）為展開劑，展開至接近薄層板上緣處取出，晾干，在254 nm紫外燈下觀察物質(zhì)斑點(diǎn)，計(jì)算比移值（Rf）。Rf＝點(diǎn)樣原點(diǎn)至斑點(diǎn)中心距離／點(diǎn)樣原點(diǎn)至溶劑前沿距離。

Fig．1 Synthetic route o f N-benzoy-3′-acetyl-gem citabine（BAG）．Gem：gem citabine；BG：N-benzoyl gem citabine；BTG：N-benzoyl-4-tert-butyl dimethyl silylgem citabine；BATG：N-benzoyl-3′-acetyl-4-tert-butyldimethyl silylgem citabine；BAG：N-benzoy-3′-acetyl-gem citabine．

1．4．2 光譜法

取BAG 20 mg·L－1甲醇溶液和Gem 20 mg·L－1水溶液，依《中國藥典》第二部（2010版）附錄ⅣA紫外可見分光光度法檢測最大吸收波長。按照常規(guī)光譜檢測方法，對BAG進(jìn)行核磁共振氫譜、核磁共振碳譜、紅外光譜和質(zhì)譜的檢測。

1．5 BAG聚合物膠束制備和理化性質(zhì)測定

取BAG 0．025 g和P188 0．050 g（BAG∶P188＝10∶1，m o l／m o l）溶于5 m L四氫呋喃中，得到5 g·L－1的BAG四氫呋喃溶液，取2 m L用100μL的微量注射器分次注入到渦旋振蕩的2 m L水中，37℃水浴加熱除去溶劑和部分水分。用2%磷鎢酸溶液對膠束進(jìn)行負(fù)染，透射電鏡觀察聚合物膠束微觀形態(tài)。用激光粒度儀測定聚合物膠束粒徑分布和Zeta電位?？瞻拙酆衔锬z束制備同上，只注入含P188的乙醇／四氫呋喃（5∶1，V／V）溶液到水中，水浴加熱除溶劑。

1．6 測定BAG聚合物膠束載藥量

建立HPLC法測定BAG。色譜條件如下：VenusilMP C18柱（5μm，250 mm×4．6 mm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：甲醇∶水（90∶10，V／V）；流速：1 m L·m in－1；進(jìn)樣量：20μL；檢測波長：261 nm。BAG的保留時(shí)間為4 m in。取5 mg BAG溶于5 m L THF，得1 g·L－1BAG標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋至0．5，1，10，20，50，70和100 mg·L－1。以峰面積（A）對濃度（c）作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A＝74337c－37047（R2＝0．999）。將BAG聚合物膠束用甲醇稀釋100倍，過0．22μm濾膜，取續(xù)濾液，測定聚合物膠束中BAG含量。BAG聚合物膠束的載藥量（%）＝〔BAG（m g）／BAG（m g）＋P188（mg）〕×100%。

1．7 BAG聚合物膠束體外抑瘤活性評價(jià)

將人乳腺癌細(xì)胞MCF-7用DMEM培養(yǎng)液稀釋至1×107L－1，接種于3塊96孔板，每孔200μL，于5%CO2，37℃飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度Gem水溶液和BAG膠束溶液，兩者分別以水和空白聚合物膠束溶液作為對照。Gem和BAG聚合物膠束的終濃度分別為5，10，20，30，50，70和90μmol·L－1。培養(yǎng)24，48和72 h后，除去培養(yǎng)液，每孔加MTT溶液20μL，4 h后加150μL二甲亞砜溶液溶解，于酶標(biāo)儀590 nm處測各孔A590nm，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率［13］。抑制率（%）＝（對照組A590nm－實(shí)驗(yàn)組A590nm）／對照組A590nm×100%。

1．8 BAG聚合物膠束體內(nèi)抑瘤活性評價(jià)

無菌條件下抽取荷肝癌細(xì)胞H22小鼠腹水，生理鹽水稀釋至2×1010L－1。小鼠皮下接種0．2 m L H22細(xì)胞于右前側(cè)腋下，7 d后腋下有隆起腫瘤硬塊即為建模成功。取腫瘤大小均勻的小鼠，隨機(jī)分為6組，模型組（iv給予等體積生理鹽水）、模型＋P188空白膠束組（尾靜脈iv，40 m g·kg－1）、模型＋Gem注射組（尾靜脈iv，40 m g·kg－1）、模型＋Gem口服組（ig，40 mg·kg－1）、模型＋BAG聚合物膠束注射組（尾靜脈iv，62 mg·kg－1，與Gem 40 mg·kg－1等量）和模型＋BAG聚合物膠束口服組（ig，62 mg·kg－1），每組6只。間隔2 d給藥1次，共3次。末次給藥后第2天處死，取出腫瘤，稱瘤濕重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率（%）＝（正常對照組平均瘤重－給藥組平均瘤重）／正常對照組平均瘤重×100%。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 BAG結(jié)構(gòu)確認(rèn)

BAG的氫譜、碳譜、紅外光譜和質(zhì)譜結(jié)果如下：1H NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：2．100（s，3H，O-CO-CH3），4．356（s，1H，OH），5．768（t，1H），7．510-7．548，8．005-8．026（m，6H，5-CH，苯基），8．001（s，1H，NH），11．448（t，1H）；13C NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ（ppm）：21．0（CH3），59．0（-CH2OH），121．5（-CF2-），128．5-133．0（苯基），167．3，169．1（-CO-）；FT-IR（KBr，cm－1）：3489．4（-CH2OH），3387．7（C-NH）；3143．4-3077．2，840．7，710．5（＝CH），2964．2-2941．8（CH2，CH3），1749．9（-COO-），1712．6（-CO-），1656．9（-CO-NH-）；ESI-MS（＋）m／z：410．11（M＋H）＋，432．15（M＋Na）＋；ESI-MS（-）m／z：408．10（M-H）＋。BAG是在Gem氨基基團(tuán)和糖環(huán)4-OH上分別連接苯甲酰和乙酰基。因?yàn)锽AG的1H NMR，13C NMR及紅外光譜均顯示有甲基基團(tuán)、-CO-NH-基團(tuán)和苯環(huán)特征峰，表明BAG合成成功。

薄層色譜法驗(yàn)證BAG的Rf為0．8，而Gem的Rf為0，前者呈較強(qiáng)非極性，與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)。BAG的最大吸收波長為261 nm，而Gem為258 nm。兩者相近又不同，表明它們的母核相同，但具體結(jié)構(gòu)不同。

2．2 BAG聚合物膠束的理化性質(zhì)

BAG是脂溶性分子，可插入P188膠束的疏水性內(nèi)核中。透射電鏡顯示，BAG聚合物膠束呈球狀，分布均勻（圖2）。BAG聚合物膠束粒徑為62．82 nm，分布較均勻（圖3A）；Zeta電位為－18．8 m V（圖3B）。雖然BAG聚合物膠束的表面電位較小，但聚合物膠束外層為長鏈的聚氧乙烯，阻止了膠束聚集和融合，保證了穩(wěn)定性。BAG聚合物膠束載藥量為（32．83±1．15）%，可滿足給藥需求。

Fig．2 Negatively-stained transm ission elec tron m icroscope image o f BAG po lymeric m icelles．The arrow shows BAG polymeric m icelles．The morphology of BAG polym eric m icelles was spheres and m icelles distributed evenly．

Fig．3 Size d istribu tion（A）and zeta po ten tia l（B）o f BAG po lym eric m icelles．The measurement was performed on Malvern Zetasizer Nano ZS using the laser dynam ic light scattering m ethod．The peak of num ber m ode size distribution was 68．62 nm．The zeta potentialwas 18．8 m V．

2．3 BAG聚合物膠束體外對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明，Gem或BAG聚合物膠束0～90μmol·L－1（0濃度的BAG聚合物膠束表示空白聚合物膠束）與人乳腺癌細(xì)胞MCF-7培養(yǎng)24，48和72 h，抑制細(xì)胞生長的IC50分別為40．6和90．0，5．0和14．9，5．0和13．6μmol·L－1，表明Gem體外對MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用強(qiáng)于BAG聚合物膠束。另外，空白聚合物膠束在72 h內(nèi)的細(xì)胞抑制率均＜10%，表明空白膠束的細(xì)胞毒性很小，BAG聚合物膠束對MCF-7細(xì)胞抑制作用主要來源于BAG分子。

Fig．4 lnhibition o f BAG po lymeric m icelles and Gem so lu tion on MCF-7 cells in cubated fo r 24（A），48（B）and 72 h（C）．，n＝3．*P＜0．05，**P＜0．01，compared with BAG polym eric m icelles group of the same concentration．

2．4 BAG聚合物膠束體內(nèi)對肝癌細(xì)胞H22移植瘤小鼠的抗腫瘤作用

由表1可見，① 與模型對照組比較，模型＋P188空白膠束（iv）、模型＋Gem口服和模型＋Gem注射組瘤重明顯減輕（P＜0．01）；與模型＋P188空白膠束（iv）組比較，BAG聚合物膠束口服和注射組瘤重亦明顯減輕（P＜0．05，P＜0．01）；表明P188空白膠束、Gem口服和注射及BAG聚合物膠束口服和注射對H22移植瘤均具有明顯的抑瘤作用。②與模型＋Gem口服組比較，模型＋BAG聚合物膠束口服組瘤重減輕（P＜0．05），抑瘤率達(dá)47．1%，表明BAG聚合物膠束口服抑瘤作用強(qiáng)于Gem口服給藥。③與模型＋BAG聚合物膠束口服組比較，BAG聚合物膠束注射給藥抑瘤作用更明顯（P＜0．05）。④與模型＋Gem注射組比較，模型＋BAG聚合物膠束注射組瘤重?zé)o顯著性差異，兩組抑瘤率均達(dá)到80%以上，表明BAG聚合物膠束靜脈給藥其抑瘤作用與Gem相當(dāng)。

Tab．1 Tum o r inhib ition o f BAG po lym eric m ice lles and Gem on hepatoma cells H22xenograft in m ice

3 討論

本研究設(shè)計(jì)并合成了Gem脂質(zhì)衍生物BAG，用注入法制備得到高度分散、均勻的含P188的BAG聚合物膠束。聚合物膠束常采用透析法［14－15］、薄膜分散法［16］和固體分散法［17］等方法制備。透析法制備時(shí)間長，換液頻繁，藥物易泄漏；因脂質(zhì)衍生物形成的膜親水性差，不易分散于水，所以用薄膜分散法制備也比較困難；固體分散法對藥物和載體要求較高，不易實(shí)現(xiàn)。本研究采用本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典的渦旋注入法［18－19］，能有效分散藥物，可得到均勻混懸液，且耗時(shí)短，工藝簡單。一般認(rèn)為粒子的zeta電位絕對值大于30 m V時(shí)，由于靜電相斥作用使體系較穩(wěn)定。雖然載BAG的P188膠束zeta電位為－18．8 m V，但泊洛沙姆結(jié)構(gòu)中親水性聚氧乙烯長鏈有利于膠束穩(wěn)定，減少了聚集和融合。

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Gem和BAG聚合物膠束與MCF-7細(xì)胞作用48和72 h，在濃度＜30μmol·L－1時(shí)，BAG聚合物膠束對MCF-7細(xì)胞的抑制作用明顯小于Gem；但當(dāng)濃度＞30μmo l·L－1時(shí)，BAG聚合物膠束對MCF-7細(xì)胞的抑制作用與Gem相當(dāng)。因此推測，BAG聚合物膠束發(fā)揮細(xì)胞毒性作用必須達(dá)到一定時(shí)間和濃度。一定時(shí)間是指有足夠時(shí)間BAG可解離成Gem，一定濃度指有足夠量Gem的產(chǎn)生。該結(jié)果也證明了BAG必須生成Gem后才能發(fā)揮對MCF-7細(xì)胞生長的抑制作用。同時(shí)表明，BAG可能會(huì)產(chǎn)生緩釋效應(yīng)。由于細(xì)胞培養(yǎng)液中酶很少，使BAG的降解緩慢。BAG進(jìn)入體內(nèi)后，酶活性較強(qiáng)，可能較快釋放出活性分子。同一濃度BAG聚合物膠束在48和72 h藥效均明顯高于24 h，說明BAG聚合物膠束有緩釋作用，這是其優(yōu)勢之一。

據(jù)報(bào)道，H22荷瘤雌性小鼠腫瘤重量和體積均明顯大于雄性小鼠［20］，為充分體現(xiàn)藥效，避免腫瘤體積過大，本研究體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)選用雄性小鼠。研究結(jié)果表明，P188空白膠束靜脈注射后也具有一定抑瘤作用，這主要是由于泊洛沙姆作為非離子型表面活性劑，能增加細(xì)胞膜流動(dòng)性、消耗ATP并抑制藥物外排有關(guān)［21］。載藥后，抑瘤作用進(jìn)一步增強(qiáng)。靜脈注射給藥時(shí)，BAG聚合物膠束抑瘤作用與等劑量Gem相當(dāng)，口服給藥時(shí)抑瘤作用明顯優(yōu)于Gem口服給藥。目前臨床上Gem不能口服，原因是藥物很容易在胃腸道中失活。而Gem脂質(zhì)衍生化后，不存在脫氨基反應(yīng)，因此可能增加了藥物的胃腸道吸收。BAG聚合物膠束口服給藥時(shí)，藥效雖不及注射給藥，但仍有一定抑瘤作用，這為Gem脂質(zhì)衍生物口服給藥應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。給藥前隨機(jī)分組，給藥后小鼠體質(zhì)量均有所增加，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（數(shù)據(jù)略），表明BAG聚合物膠束毒性較小。

目前Gem上市制劑為其鹽酸鹽注射劑，無法口服。Gem注射劑在體內(nèi)降解快，毒性大，患者依從性差?？诜﨎AG聚合物膠束有較明顯抑瘤作用，為基于Gem的藥物治療提供了口服給藥可能。下一步將改進(jìn)Gem衍生化路線，以增強(qiáng)口服給藥效果且達(dá)到緩釋目的，同時(shí)研究其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)特征。本研究為Gem的腫瘤靶向治療和制備口服制劑提供了一種新思路，有較好的臨床應(yīng)用前景。

［1］ Maeda H．The enhanced perm eability and reten-tion（EPR）effect in tumor vasculature：the key role of tumor-selectivemacromolecular drug targeting［J］．Adv Enzyme Regul，2001，41：189-207．

［2］ Mitra S，Gaur U，Ghosh PC，Maitra AN．Tum our targeted de livery o fencapsulated dextran-doxorubicin con jugate using chitosan nanoparticles as carrier［J］．J Control Release，2001，74（1-3）：317-323．

［3］ Paolino D，Cosco D，Racanicchi L，Trapasso E，Celia C，Iannone M，et al．Gem citabine-loaded PEGylated unilamellar liposomes vs GEMZAR：biodistribution，pharmacokinetic features and in vivo antitumor activity［J］．J Control Release，2010，144（2）：144-150．

［4］ Du B，LiY，Li X，A Y，Chen C，Zhang Z．Preparation，characterization and in vivo evaluation of 2-methoxyestradiol-loaded liposom es［J］．Int J Pharm，2010，384（1-2）：140-147．

［5］ She W，Li N，Luo K，Guo C，Wang G，Geng Y，et al．Dendronized heparin-doxorubicin con jugate based nanoparticle as pH-responsive drug delivery system for cancer therapy［J］．Biomate ria ls，2013，34（9）：2252-2264．

［6］ Fadel M，Kassab K，F(xiàn)adeel DA．Zinc phthalocyanine-loaded PLGA biodegradab le nanoparticles for photodynam ic therapy in tumor-bea ring m ice［J］．Lasers Med Sci，2010，25（2）：283-292．

［7］ Liu L，Tang Y，Gao C，LiY，Chen S，Xiong T，et al．Charac terization and biodistribution in vivo of quercetin-loaded cationic nanostructured lipid carriers［J］．Colloids Surf B Biointerfaces，2014，115：125-131．

［8］ Mu CF，Balakrishnan P，Cui FD，Yin YM，Lee YB，ChoiHG，et al．The effects ofm ixed MPEGPLA／Pluronic copolymer m icelles on the bioavailability and multidrug resistance of docetaxel［J］．Biomaterials，2010，31（8）：2371-2379．

［9］ Coimbra M，Rijcken CJ，Stigter M，Hennink WE，Storm G，Schiffelers RM．An titumor efficacy of dexamethasone-loaded core-crosslinked polymeric m icelles［J］．J Control Release，2012，163（3）：361-367．

［10］ W ang XJ．Progerss on clinical research of cem citabine［J］．J Oncol（腫瘤學(xué)雜志），2005，11（1）：69-71．

［11］ Moysan E，Bastiat G，Benoit JP．Gem citabine versus Modified Gem citabine：a review of several prom ising chem icalmodifications［J］．Mol Pharm， 2013，10（2）：430-444．

［12］ Alexander RL，Morris-Natschke SL，Ishaq KS，F(xiàn)lem ing RA，Kucera GL．Synthesis and cytotoxic ac tivity of two novel 1-dodecylthio-2-decyloxypropyl-3-phosphatidic acid conjugates with gemcitabine and cytosine arabinoside［J］．JMed Chem，2003，46（19）：4205-4208．

［13］ Wei M，Xiao Y．Nephrotoxicity o f gem citabine on human breast cancer cell MCF-7 and human ermbryonic kidney cell 293 in vitro［J］．Chin Hosp Pharm J（中國醫(yī)院藥學(xué)雜志），2011，31（8）：632-635．

［14］ Sezgin Z，Yüksel N，Baykara T．Preparation and characterization of polymeric m icelles for solubilization of poorly soluble anticancer drugs［J］．Eur J Pharm Biopharm，2006，64（3）：261-268．

［15］ Shiraishi K，Kawano K，Minowa T，Maitani Y，Yokoyama M．Preparation and in vivo imaging o f PEG-poly（L-lysine）-based polymeric m icelle MRI contrastagents［J］．JContro lRelease，2009，136（1）：14-20．

［16］ Wei Z，Hao J，Yuan S，Li Y，Juan W，Sha X，e t al．Paclitaxel-loaded Pluronic P123／F127 m ixed po lymeric m icelles：formulation，optim ization and in vitro cha racterization［J］．Int J Pharm，2009，376（1-2）：176-185．

［17］ Song L，Shen YY，Hou JW，Lei L，Guo SR，Qian CY．Polymeric m ice lles for parente ral delivery o f cu rcum in：Preparation，cha racterization and in vitro evaluation［J］．Colloid Surf A：Physicochem Engin Asp，2011，390（1－3）：25-32．

［18］ Jin Y，Xin R，Tong L，Du L，Li M．Combina tion an ti-HIV therapy w ith the self-assemblies of an asymmetric bolaamphiphilic zidovudine／didanosine prodrug［J］．Mol Pharm，2011，8（3）：867-876．

［19］ Jin Y，Yang F，Du L．Nanoassemblies containing a fluorouracil／zidovudine glyceryl p rodrug w ith phospholipase A2-triggered drug release for cancer treatment［J］．Colloids Surf B Biointerfaces，2013，112：421-428．

［20］ Chen RT，Chen B，Xia Y，Yue F，Wang Q．Effects of gender on the grow th of tum or in m ice loaded w ith H22liver cance r［J］．Chin Occup Med（中國職業(yè)醫(yī)學(xué)），2008，35（4）：283-285．

［21］ Dumortier G，Grossiord JL，Agnely F，Chaumeil JC．A review of poloxamer 407 pharmaceuticaland pharmacological characteristics［J］．Pharm Res，2006，23（12）：2709-2728．

Preparation，physicochem ical p roperties and an ti-tum or activity o f po lym eric m icelles o f one gem citabine lip id derivative

ZUO Jing1，2，YANG M ing3，LIM iao2，DU Li-na2，JIN Yi-guang1，2
（1．Graduate Schoo l，AnhuiMedical University，He fei 230032，China；2．Departm ent o f Pharm aceutica l Sciences，Institute o f Radiation Medicine，Academ y o f M ilitary Medical Sciences，Beijing 100850，China；3．Co llege o f Life Science and Technology，Beijing University o f Chem ica l Techno logy，Beijing 100029，China）

OBJECTlVE To prepare a lipid derivative of gem citabine（Gem）and its polymeric m icelles to overcome the disadvantages of Gem．METHODS N-benzyl-3′-acetyl-gemcitabine（BAG）was synthesized．A BAG-loaded poloxamer polymeric m icelle（BAG∶poloxamer 188＝10∶1，mol／mol）was p repared using an in jection method．The m icelles were characterized w ith a laser partic le size and e lectric charge instrum ent and negative ly-stained transm ission e lectron m icroscopy．Human breast cancer ce lls MCF-7 were cu ltured w ith Gem or BAG po lym eric m ice lles o f 5，10，20，30，50，70，90μmo l·L－1for 24，48 and 72 h，respective ly．The inhibitory rate o f ce lls was m easured w ith an MTT m ethod．The MCF-7 cytotoxicity of BAG po lym eric m ice lles was investigated．A pharmacodynam ic study was performed on the m ice bearing mouse hepatocellular cancer cells H22．Intravenous（iv）and oral（ig）adm inistration was used at the dose ofGem 40 mg·kg－1or BAG polymericm icelles 62 mg·kg－1．The m ice were adm inistered on the 1st，4th and 7th day and sacrificed on the 8th day．Tumor inhibitory rates were m easured．RESULTS The BAG structure was identified by thin layer chrom atograph，1H and13C NMR，in frared ray chromatograph and mass spectrum．The appearance of BAG m ice lles was a slightly b lue suspension．The m ice lles were spheres according to the electron m icroscopic observation．Their size was 62．82 nm and the zeta potentia l was－18．8 m V．The half inhibition concentration（IC50）o f Gem and BAG po lymeric m icelles was 40．6 and 90．0μm o l·L－1，5．0 and 14．9μm ol·L－1，5．0 and 13．6μmol·L－1at24，48 and 72 h，respectively according to the MTT results．According to the in vivo results，compared w ith the tumormodel group，Gem（ig），Gem（iv）and BAG polymeric m icelles（iv and ig）had significanteffecton the tumorweightofH22cellxenograftm ice（P＜0．01）．As foranti-tumor efficiency，BAG polymericm icelles（ig）were better than Gem（ig）（P＜0．05）；BAG polymeric m icelles（iv）were better than BAG po lym eric m ice lles（ig）（P＜0．05），and BAG po lym eric m ice lles（iv）were a lm ost equal to Gem（iv）．CONCLUSlON The lipid derivative o f Gem can be loaded in the po loxam er 188 po lym eric m ice lles．BAG po lym eric m ice lles show in vitro MCF-7 ce ll inhibition and in vivo inhibition o fmouse H22xerogra fts；iv or ig．BAG polym eric m ice lles（ig）show better anti-tum or effect than Gem（ig），indicating that BAG polym eric m ice lles are a p rom ising nove l anti-tum or ora l p reparation．

gem citabine；lipid derivatives；po lym eric m ice lles；antineop lastic agents

s：DU Li-na，Tel：（010）66930216，E-mail：dulina＠188．com；JIN Yi-guang，Tel：（010）66931220，E-mail：jinyg＠139．com

R979．1，R943

A

1000-3002（2014）03-0408-07

Foundation item：The pro jec t suppo rted by National Key Technologies R＆D Program fo r New Drugs（2012ZX09301003-001-009）；and Nationa l Natura l Science Foundation of China（81072598）

2014-01-28 接受日期：2014-05-19）

（本文編輯：齊春會(huì)）

國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301003-001-009）；國家自然科學(xué)基金（81072598）

左 靖（1988－），女，碩士研究生，主要從事靶向給藥新劑型研究；杜麗娜（1977－），女，博士，副研究員，主要從事納米靶向制劑和經(jīng)皮給藥制劑研究；金義光（1973－），男，博士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事分子藥劑學(xué)研究。

杜麗娜，E-mail：dulina＠188．com，Tel：（010）66930216；金義光，E-mail：jinyg＠139．com，Tel：（010）66931220