張光甫，劉薇，*，邢立國，胥維

1. 大連理工大學(xué)環(huán)境學(xué)院工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116024 2. 中化集團(tuán)沈陽化工研究院有限公司，沈陽110027

化妝品、農(nóng)藥等接觸類物質(zhì)，依據(jù)安全管理要求，進(jìn)入市場之前須經(jīng)過皮膚腐蝕/刺激性測試。傳統(tǒng)檢測方法都采用活體動(dòng)物皮膚實(shí)驗(yàn)，給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造成巨大的痛苦，而且每年動(dòng)物使用量呈逐年增加趨勢，不符合“3R”原則[1]。為了減少動(dòng)物使用，體外皮膚模型替代方法的開發(fā)和驗(yàn)證取得快速發(fā)展，開發(fā)了如Episkin、SkinEthic和EpiDerm皮膚模型等[2-4]。歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)經(jīng)過大量的驗(yàn)證工作，于2007年4月公告Episkin可作為Draize皮膚刺激性替代方法，成為第一個(gè)被認(rèn)證的模型，隨后EpiDerm、SkinEthic也得到認(rèn)證。2008年美國EPA、NIH和NIP協(xié)議未來十年內(nèi)減少動(dòng)物在化學(xué)品安全評(píng)價(jià)中的使用，歐盟立法2009年3月起禁止動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用于化妝品安全性評(píng)價(jià)[5]，進(jìn)一步推動(dòng)了皮膚模型替代方法的發(fā)展和應(yīng)用。我國在重組皮膚模型的研究，近年來也取得了較快的發(fā)展[6-8]。

目前體外皮膚模型在農(nóng)藥化學(xué)品評(píng)價(jià)中的應(yīng)用非常有限，仍需進(jìn)一步研究。我國作為農(nóng)藥品生產(chǎn)大國，農(nóng)藥品的腐蝕/刺激性替代方法的研究同樣迫在眉睫。殺菌劑作為農(nóng)藥中重要的一類產(chǎn)品，近年來的使用量和整體比重呈上升趨勢[9]。目前國內(nèi)的皮膚腐蝕/刺激性檢驗(yàn)，主要依據(jù)動(dòng)物皮膚腐蝕/刺激性檢測方法(GB15670-1995)。本研究通過人皮膚模型在殺菌類農(nóng)藥皮膚腐蝕/刺激性評(píng)價(jià)中應(yīng)用，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)替代方法用于農(nóng)藥類化學(xué)品安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料(Materials)

1.1 試劑與儀器

試劑：人表皮角化細(xì)胞(HEK)、成人真皮纖維原細(xì)胞(HDF-a)(上海佛雷堡生物有限公司)，K-SFM培養(yǎng)基(Gibco公司)，鼠尾膠原(北京鴻躍有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶(0.04%EDTA)、胎牛血清(Hyclone公司)，MTT試劑(BioSHARP公司)，TritonX-100、正辛酸、十二烷基硫酸鈉SLS分析純試劑(國藥藥業(yè)有限公司)、人白介素-1aELISA試劑盒(R&D公司)，10種農(nóng)藥包括嘧菌酯原藥、肟菌酯原藥、丁香菌酯原藥、唑胺菌酯原藥、苯醚菌酯原藥、唑菌酯原藥、SYP-11545、SYP-14380、SYP-13409、SYP-12194純度均在95%以上(中國中化集團(tuán)公司提供)、大耳白兔(日本)。

儀器：Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)，倒置顯微鏡(CKX31，Olympus公司)，CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)，離心機(jī)(5430，Eppendorf公司)，多功能酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法(Methods)

1.2.1 人皮膚模型的建立

人皮膚模型的構(gòu)建方法，依據(jù)EpiDerm的構(gòu)建原理。皮膚模型包括表皮層和真皮層兩部分，分別通過利用成人真皮纖維原和鼠尾膠原模擬具有支撐作用的真皮層，利用人角化細(xì)胞模擬上面的表皮層，從而得到構(gòu)建的皮膚模型[10-11]。

由人成纖維細(xì)胞和鼠尾膠原蛋白混合培養(yǎng)模擬真皮層。(1)將生長狀態(tài)良好的人成纖維細(xì)胞消化、重懸，制成約為5×105個(gè)·mL-1濃度的細(xì)胞懸液；(2)冰浴條件下，取1 mL鼠尾膠原與60 μL 0.1 mol·L-1NaOH溶液混合；(3)迅速將鼠尾膠原混合液與4 mL細(xì)胞懸液混合；(4)將以上混合液以每孔600 μL的量加入Transwell，在37 ℃培養(yǎng)箱中放置0.5～1 h，待膠原凝固后，加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，浸沒培養(yǎng)5～6 d，隔天換液。

HEK細(xì)胞在上述真皮層基質(zhì)表面上模擬表皮層。(5)接種2×106個(gè)·mL-1濃度的人角化細(xì)胞，同時(shí)更換為K-SFM培養(yǎng)基，隔天換液。(6)每天觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，當(dāng)表層角化細(xì)胞融合率達(dá)90～95%時(shí)，改為氣液培養(yǎng)5～6 d，表面細(xì)胞角質(zhì)化，獲得所需的人皮膚模型。

1.2.2 人皮膚模型的屏障功能測試

皮膚模型方法相比細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，其三維結(jié)構(gòu)更好的模擬了人皮膚，可反映不同細(xì)胞之間的級(jí)聯(lián)毒性作用。且細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)低溶解度化合物進(jìn)行測試時(shí)，結(jié)果可能受助溶劑干擾，而人皮膚模型則不受測試物的劑型的影響。同時(shí)皮膚模型模擬了皮膚中具有屏障功能的角質(zhì)層，提高其與動(dòng)物測試方法結(jié)果的一致性。利用1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)評(píng)價(jià)皮膚模型的屏障功能[2]。TritonX-100(1%)在皮膚模型上作用不同時(shí)間點(diǎn)t=0、1、2、3、4、5 h，用無菌PBS沖洗皮膚模型5～6次，最后利用MTT法測定模型活性(OD570)，計(jì)算得出組織活性減少50%時(shí)所需的作用時(shí)間(ET50)。

進(jìn)一步利用十二烷基硫酸鈉(SLS)對(duì)皮膚模型屏障性驗(yàn)證[12]，將不同濃度SLS(c=0、0.16、0.8、4、20、100 mg·mL-1)作用于皮膚模型，作用時(shí)間達(dá)到18 h后，用無菌PBS去掉殘留農(nóng)藥，最后用MTT法測定組織模型活性(OD570)，計(jì)算組織活性減少50%時(shí)，所需的暴露劑量(IC50)。

1.2.3 皮膚腐蝕和刺激性測試方法

皮膚模型腐蝕性測試方法參考OECD化學(xué)品測試指南(TG431)[13]。待測化學(xué)物按25 μL·cm-2(液體)或25 mg·cm-2(固體)，均勻作用于皮膚模型(N=3)3 min或1 h，之后利用MTT法測定組織模型的活性。通過相對(duì)細(xì)胞活性評(píng)價(jià)待測品的腐蝕性。

皮膚模型的刺激性測試方法，依據(jù)OECD化學(xué)品測試指南(TG439)[14]。首先待測化學(xué)物按25 μL·cm-2(液體)或25 mg·cm-2(固體)，均勻涂于皮膚模型作用15 min，之后用無菌PBS沖洗，再將皮膚模型轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)42 h，最后通過測定培養(yǎng)基中組織活性和白介素-1a，判斷待測品的刺激性。白介素-1a(IL-1a)是皮膚受到刺激時(shí)，產(chǎn)生的一種細(xì)胞因子，含量與待測物的刺激性存在劑量效應(yīng)關(guān)系[15]。皮膚模型暴露42 h后，通過ELISA法測定培養(yǎng)基中IL-1a含量，首先取42 h培養(yǎng)后的培養(yǎng)液和試劑盒中的IL-1a標(biāo)準(zhǔn)品，分別按40 μL和50 μL的量加入96孔板，每個(gè)樣品做2個(gè)平行對(duì)照；在樣品孔中加入10 μL一抗和50 μL的酶標(biāo)試劑，標(biāo)準(zhǔn)品中只加50 μL酶標(biāo)試劑，蓋上封板膜37 ℃溫育60 min；洗滌液洗板5次，加入A、B兩種顯色液，避光37 ℃顯色10 min，最后每孔加入50 μL終止液，在450 nm處測定吸光度。利用標(biāo)樣首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.009X+0.021，當(dāng)X=60時(shí)，Y=0.561。根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶標(biāo)儀450 nm處對(duì)樣品的測定結(jié)果，計(jì)算IL-1a含量并用pg·mL-1表示。即：光吸收值大于0.561時(shí)，該農(nóng)藥品能使皮膚組織模型IL-1a量超過60 pg·mL-1，說明該農(nóng)藥品具有皮膚刺激性。

人皮膚模型對(duì)殺菌類農(nóng)藥品的腐蝕性/刺激性測試，每種受試物進(jìn)行3個(gè)平行測試，采用無菌PBS作為陰性對(duì)照，分別采用正辛酸和SLS作為腐蝕性和刺激性測試的陽性對(duì)照物。

1.2.4 農(nóng)藥腐蝕/刺激性動(dòng)物測試

參考OECD和我國化學(xué)品腐蝕/刺激性試驗(yàn)方法(OECD TG404;GB15670 -1995)設(shè)計(jì)試驗(yàn)[16-17]。

液體受試物0.5 mL，固體受試物用0.5%的羧甲基纖維素配制0.5 g·mL-1的懸濁液涂在2.5 cm×2.5 cm大小去毛的一側(cè)皮膚上，另一側(cè)皮膚作為對(duì)照，每組4只兔子平行對(duì)照，涂勻后用無刺激性的繃帶和膠布固定。未知受試物具有腐蝕性的情況下，測試過程分3步觀察：(1)作用3 min后移去觀察，如未見嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)，繼續(xù)作用至1 h后觀察。(2)無明顯反應(yīng)下，作用4 h后觀察皮膚癥狀，判斷是否具有腐蝕性。(3)無明顯反應(yīng)下，對(duì)兔子皮膚連續(xù)觀察24、48、72 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)，如出現(xiàn)損傷觀察14 d結(jié)束，根據(jù)皮膚損傷的程度及恢復(fù)情況給出評(píng)分，判斷刺激性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與判定標(biāo)準(zhǔn)

表1 腐蝕性鑒別標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Standard of corrosion identification

表2 刺激性鑒別標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Standard of irritation identification

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 人皮膚模型的功能評(píng)價(jià)

本研究建立的皮膚模型陰性對(duì)照組細(xì)胞相對(duì)活性大于0.6，證明皮膚模型具有良好的活性。本研究中，TritonX-100對(duì)人皮膚模型的細(xì)胞活性的影響，隨時(shí)間的延長其活性降低。通過表3的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系得出ET50為2.2 h。本實(shí)驗(yàn)為更充分的驗(yàn)證皮膚模型屏障功能，又選用了SLS對(duì)人皮膚模型進(jìn)行不同濃度的作用測試。表3給出了在不同濃度SLS作用18 h后的相對(duì)細(xì)胞活性。SLS對(duì)皮膚模型的IC50為1.71 mg·mL-1。參考物質(zhì)TritonX-100和SLS2種化學(xué)品對(duì)人皮膚模型的ET50大于2 h，IC50在1.0～3.0 mg·mL-1范圍，符合相關(guān)參考標(biāo)準(zhǔn)[13-14,18]。

皮膚腐蝕/刺激性的傳統(tǒng)方法是借助實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，觀察動(dòng)物皮膚對(duì)受試物的反應(yīng)。其生理機(jī)制是化學(xué)分子透過角質(zhì)層，損傷細(xì)胞引起細(xì)胞的死亡，從而釋放大量的細(xì)胞因子，激活炎癥反應(yīng)信號(hào)通路。炎癥分子進(jìn)一步作用于真皮細(xì)胞中的基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞擴(kuò)張通透性增加最終導(dǎo)致紅斑和水腫。體外構(gòu)建的皮膚模型測試方法不同于二維細(xì)胞毒性試驗(yàn)，因?yàn)榧?xì)胞毒性方法中的細(xì)胞微環(huán)境相對(duì)皮膚模型與真實(shí)皮膚的差異更大，并且忽略了不同細(xì)胞之間的相互作用。而體外皮膚模型替代實(shí)驗(yàn)方法正是針對(duì)此級(jí)聯(lián)效應(yīng)和初始反應(yīng)設(shè)計(jì)的。角質(zhì)層的形成使皮膚模型模擬了受試物與皮膚的作用機(jī)制，顯著提高了體外皮膚模型測試結(jié)果與動(dòng)物試驗(yàn)方法的一致性，因此體外皮膚模型的屏障功能評(píng)價(jià)是該替代方法的重要質(zhì)量控制/質(zhì)量保證措施。此外，陽性對(duì)照物正辛酸和SLS的鑒別結(jié)果準(zhǔn)確(表4,5)。表明本研究建立的人皮膚模型具有較好的性能，能夠準(zhǔn)確反映受試化合物的皮膚腐蝕性/刺激性。

表3 人皮膚模型的屏障功能測試Table 3 Test of the barrier function of the human skin model

2.2 人皮膚模型對(duì)殺菌類農(nóng)藥品的腐蝕性測試 3組平行測定的結(jié)果，滿足RSD≤18%的要求。在對(duì)殺菌類農(nóng)藥品的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在3 min、1 h、4 h暴露作用時(shí)間點(diǎn)的皮膚反應(yīng)中，沒有明顯的變化和損傷。在人皮膚模型對(duì)10種殺菌類農(nóng)藥品3 min暴露作用的腐蝕性預(yù)實(shí)驗(yàn)中，測定相對(duì)細(xì)胞活性都在97%以上。1 h后相對(duì)細(xì)胞活性降低到61.7～96.0%。3 min時(shí)可能由于農(nóng)藥品與皮膚模型作用時(shí)間較短，難以充分反應(yīng)受試物對(duì)皮膚模型的腐蝕性。因此本實(shí)驗(yàn)采用了1 h暴露作用時(shí)間，根據(jù)1 h后的相對(duì)細(xì)胞活性判斷，受試物屬于無腐蝕性(表4)。比較皮膚模型和動(dòng)物測試結(jié)果(表4,5)，可得出兩者的鑒別結(jié)果完全一致。

2.3 人皮膚模型對(duì)殺菌類農(nóng)藥品的刺激性測試

細(xì)胞活性作為檢測終點(diǎn)時(shí)，皮膚模型對(duì)殺菌類農(nóng)藥品刺激性篩選鑒別結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥品3(丁香菌酯)、5(苯醚菌酯)和7(SYP-11545)具有刺激性，其它無刺激性。動(dòng)物皮膚刺激性測試結(jié)果(表5)表明，農(nóng)藥品3(丁香菌酯)和4(唑胺菌酯)有刺激性，其它無刺激性。兩種測試方法結(jié)果的準(zhǔn)確性為70%，進(jìn)一步對(duì)刺激性相關(guān)的細(xì)胞因子(IL-1a)進(jìn)行定量分析。刺激反應(yīng)引起細(xì)胞因子包括IL-1a、IL-2和IL-8等[19]，其中IL-1a是OECD推薦的一種。Chatterjee等[20]利用皮膚模型對(duì)IL-1a和IL-8兩種因子的“時(shí)間-劑量”關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)IL-1a具有更好的對(duì)應(yīng)關(guān)系。根據(jù)表2的刺激性篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)相對(duì)細(xì)胞活性大于50%的測試組進(jìn)行IL-1a的定量分析。

表4 殺菌類農(nóng)藥對(duì)人皮膚模型的腐蝕性Table 4 The corrosion of pesticide on human skin model

注：C表示具有腐蝕性；NC表示為無腐蝕性

皮膚模型刺激性結(jié)果中相對(duì)細(xì)胞活性大于50%農(nóng)藥品的IL-1a測定結(jié)果見圖1。結(jié)合細(xì)胞相對(duì)活性和IL-1a測定結(jié)果，具有刺激性的農(nóng)藥品為3(丁香菌酯)、4(唑胺菌酯)、5(苯醚菌酯)和7(SYP-11545)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外皮膚模型的準(zhǔn)確性提高到80%。

圖1 殺菌類農(nóng)藥對(duì)人皮膚模型的刺激性Fig. 1 The irritation of pesticide on human skin model

表5 殺菌類農(nóng)藥的動(dòng)物皮膚測試結(jié)果Table 5 The corrosion/irritation of pesticide on animal skin

目前國際和國內(nèi)在體外皮膚模型的研究與應(yīng)用上，已取得一定成果。目前體外皮膚模型真皮層的模擬，包括用無活性的聚合物模擬和具有活性的成纖維細(xì)胞作為真皮層。其中采用具有活性的成纖維細(xì)胞構(gòu)建的人皮膚模型，能夠更準(zhǔn)確模擬真實(shí)人皮膚組織。且人皮膚模型目前主要應(yīng)用于化妝品的安全性評(píng)價(jià)[6-8,21-23]，鮮有利用皮膚模型在農(nóng)藥的應(yīng)用。農(nóng)藥的腐蝕/刺激性評(píng)價(jià)是安全評(píng)價(jià)中重要的部分。利用人皮膚模型替代動(dòng)物皮膚測試，將會(huì)大量減少動(dòng)物的使用量，替代實(shí)驗(yàn)的研究是今后安全性評(píng)價(jià)發(fā)展的趨勢。本研究利用構(gòu)建的人皮膚模型檢測農(nóng)藥的腐蝕/刺激性，采用1 h暴露作用時(shí)間的腐蝕性測試，其結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的一致率為100%。刺激性測試中，通過相對(duì)細(xì)胞活性和IL-1a含量兩個(gè)終點(diǎn)信號(hào)的測定，使皮膚模型的結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性達(dá)到了80%。皮膚模型在殺菌類農(nóng)藥的應(yīng)用初步表現(xiàn)出良好的性能，通過模型建立的優(yōu)化和測試終點(diǎn)的篩選，在農(nóng)藥的安全性評(píng)價(jià)中有良好的應(yīng)用前景。此外，目前對(duì)于體外皮膚模型的建立，所使用材料如Transwell培養(yǎng)板的價(jià)格較昂貴，廉價(jià)或可重復(fù)利用支架材料的開發(fā)，將會(huì)有利于降低實(shí)驗(yàn)成本，促進(jìn)人皮膚模型的推廣和應(yīng)用。

致謝：感謝沈陽化工研究院安全性評(píng)價(jià)中心謝明工程師在實(shí)驗(yàn)中的支持和幫助。

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