張諾，孫韶華，王明泉，肖芙蓉，許燕，賈瑞寶，*

1. 濟(jì)南市供排水監(jiān)測(cè)中心，濟(jì)南 250021 2. 山東省圖書(shū)館，濟(jì)南 250100

多氯代二苯并對(duì)二噁英(polychlorinated dibenzo-p-dioxins, PCDDs)，多氯代二苯并呋喃(polychlorinated dibenzofurans, PCDFs)，以及部分具有類(lèi)二噁英性質(zhì)的多氯聯(lián)苯(dioxin-like polycholorinated diphenyls, DL-PCBs)是一類(lèi)統(tǒng)稱(chēng)為二噁英的持久性有機(jī)污染物。全球歷史上發(fā)生過(guò)幾次重大的二噁英污染事件，比如1960年的日本米糠油事件，1998年的巴西黃油事件，1999年的比利時(shí)飼料、肉雞事件，2011年的德國(guó)毒飼料事件等，這些事件造成了嚴(yán)重的人員傷亡及經(jīng)濟(jì)損失，并且影響了社會(huì)穩(wěn)定[1-2]?，F(xiàn)有研究表明，二噁英在目前已知化合物中毒性最大，廣泛分布于各種介質(zhì)中，主要來(lái)自于化工生產(chǎn)過(guò)程的副產(chǎn)物、有機(jī)物焚燒過(guò)程及汽車(chē)尾氣排放等，2004年各類(lèi)源二噁英類(lèi)排放總量為10.2 kg TEQ，其中向空氣中排放5.0 kg TEQ，向水體排放0.041 kg TEQ，通過(guò)產(chǎn)品排放0.17 kg TEQ，通過(guò)殘?jiān)?、飛灰等向環(huán)境排放5.0 kg TEQ。二噁英具有難分解性和高生物蓄積性，對(duì)生物具有致癌、致畸、致突變等“三致”效應(yīng)，影響生殖功能[3]，并干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，被稱(chēng)為“世紀(jì)之毒”，目前已被國(guó)際公約列入首批控制的12種/類(lèi)持久性有機(jī)污染物的名單中，WHO國(guó)際癌癥研究中心把它歸為一級(jí)致癌物質(zhì)[4]。因此，對(duì)二噁英的檢測(cè)與控制至關(guān)重要，已成為當(dāng)前的環(huán)境焦點(diǎn)之一。

環(huán)境中二噁英分析屬超痕量、多組分分析，對(duì)分析技術(shù)的特異性、選擇性和靈敏度的要求極高[5]。目前，二噁英的測(cè)定方法主要有美國(guó)環(huán)境保護(hù)局EPAl613和l668為代表的HRGC-HRMS[6]、基于抗原-抗體的ELISA法[7]以及基于總毒性當(dāng)量(TEQ)的生物檢測(cè)法[5]等。生物檢測(cè)法所需時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)費(fèi)用較低，同時(shí)能檢測(cè)更多的樣本。其中，熒光素酶表達(dá)基因法(CALUX)作為一種高效快速、簡(jiǎn)易價(jià)廉的生物分析方法，是唯一得到美國(guó)EPA推薦使用的二噁英生物學(xué)檢測(cè)方法，并已被歐盟、美國(guó)、日本等國(guó)廣泛用于二噁英的篩選檢測(cè)中。

1 熒光素酶表達(dá)基因法原理及技術(shù)優(yōu)勢(shì)

CALUX方法首先利用基因工程技術(shù)，把哺乳動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞色素P450基因(CYPIAI)和螢火蟲(chóng)的熒光酶合成基因，重組到大鼠肝癌細(xì)胞系(H4IIE)染色體上。脂溶性二噁英類(lèi)污染物，透過(guò)細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)多環(huán)芳烴受體可逆性結(jié)合，形成配體-AhR復(fù)合物，使AhR的構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核內(nèi)配體-AhR復(fù)合體和核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ARNT)結(jié)合，形成配體-AhR-ARNT復(fù)合物，特異性的與染色體上二噁英應(yīng)答區(qū)域結(jié)合，并激活細(xì)胞色素P450基因和熒光合成酶基因合成熒光素。該測(cè)試系統(tǒng)合成的熒光素量及熒光強(qiáng)度與測(cè)定系統(tǒng)中加入的二噁英量成正相關(guān)[8-10]。

與其它二噁英的分析檢測(cè)方法相比，CALUX法具有一系列優(yōu)勢(shì)，如表1所示。CALUX生物檢測(cè)法使用高感度的細(xì)胞，加上前處理簡(jiǎn)單，擁有萃取、精制、分離等優(yōu)良技術(shù)，因此成為環(huán)境、食品等領(lǐng)域二噁英的快速檢測(cè)方法。此外，分析程序大幅度的縮短使成本大幅降低。但此類(lèi)方法只能得到總的TEQ，不能了解樣品中二噁英的具體組成。

2 熒光素酶表達(dá)基因法與同類(lèi)方法用于二噁英檢測(cè)的相關(guān)性

已有研究表明，CALUX法在牛乳樣品二噁英檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中與標(biāo)準(zhǔn)方法(HRGC-HRMS)相比結(jié)果較一致，檢測(cè)限高于活力誘導(dǎo)(EROD)法，線(xiàn)性范圍更寬，檢測(cè)限可達(dá)2.4 pm·L-1 [9,11,12]。

為了證明CALUX方法的準(zhǔn)確性和實(shí)用性，有研究者分別采用國(guó)際上公認(rèn)的HRGC-MS方法和CALUX法測(cè)定了同一批樣品中的二噁英含量，并比較了兩種分析方法測(cè)定結(jié)果之間的相關(guān)性。其結(jié)果表明，垃圾焚燒煙塵或土壤樣品(r= 0.978)、地面水(r= 0.972)、工業(yè)廢氣(r= 0.960)、人類(lèi)脂肪(r= 0.876)、母乳(r= 0.958)、卵泡液(r= 0.830)經(jīng)兩種方法測(cè)定，結(jié)果之間具有很好的正相關(guān)關(guān)系(p< 0.05)，其測(cè)定值具有很好的重現(xiàn)性[13-15]。此外，李瑩等[16]采用CALUX方法和HRGC-MS法測(cè)定同一樣品二噁英含量的結(jié)果之間具有很好的正相關(guān)，且具有很好的重現(xiàn)性，與HRGC-MS方法相比，CALUX法具有所需樣品量較小，測(cè)定周期短，測(cè)定成本低等優(yōu)點(diǎn)。金一和等[17]也分別采用HRGC-MS法和CALUX方法測(cè)定同一來(lái)源的人體脂肪、血液和母乳中二噁英毒性當(dāng)量，觀察兩種不同方法測(cè)定結(jié)果間的相關(guān)性。兩種方法測(cè)定脂肪組織和母乳中二噁英毒性當(dāng)量結(jié)果之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.8675和0.9581，具有顯著的正相關(guān)關(guān)系(p< 0.05)。二噁英毒性當(dāng)量>20 pg·g-1的血液樣品，兩種方法測(cè)定結(jié)果之間也具有密切的相關(guān)關(guān)系(p<0.05或<0.01)。因此，CALUX法簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，降低了成本，并且由于可利用基因工程技術(shù)改進(jìn)報(bào)告質(zhì)粒進(jìn)一步提高靈敏度，適用于一般人群的脂肪組織、乳汁樣品、二噁英暴露人群的血液以及環(huán)境水樣中二噁英的快速篩查[11,18]。周志廣等[19]應(yīng)用CALUX法測(cè)定了廢氣中二噁英的濃度，并與HRGC-MS方法的測(cè)定值進(jìn)行了比較，得出了二者的換算系數(shù)，換算以后的CALUX值與HRGC-MS方法值具有良好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.9948。

表1 熒光素酶表達(dá)基因法與其它方法的比較Table 1 The comparison results of CALUX with other methods

許多學(xué)者還對(duì)CALUX法和AhR-DNA結(jié)合的凝膠阻滯電泳生物檢測(cè)法(GRAB法)進(jìn)行了分析比較[20-22]。研究表明，CALUX法和GRAB法為我們提供了較便宜、較為迅速的二噁英檢測(cè)方法。對(duì)于二噁英，CALUX系統(tǒng)快速(～4 h)、靈敏，并且由于可在96孔板中進(jìn)行，從而加大檢測(cè)通量。同時(shí)，CALUX誘導(dǎo)和二噁英濃度具有良好相關(guān)性[23]。

總之，CALUX法與其它檢測(cè)方法具有一定的相關(guān)性，卻又有無(wú)可比擬的優(yōu)越性。與EROD法相比，CALUX法靈敏度較高、線(xiàn)性范圍較寬、檢測(cè)時(shí)間較短，為外源性基因不受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控影響，可采用基因工程手段進(jìn)一步改進(jìn)質(zhì)粒，進(jìn)一步提高靈敏度；與HRGC-HRMS法相比，CALUX法在樣品前處理時(shí)對(duì)分析所用的試劑純度級(jí)別和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境質(zhì)量條件要求相對(duì)較低，前處理操作簡(jiǎn)便，樣品需求量少(約1/10)，測(cè)定周期短(可縮短4/5)，檢測(cè)成本低(可降低3/4)[24]，可平行測(cè)定大量樣品；與GRAB法相比，CALUX法得到的假陽(yáng)性結(jié)果少得多，靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，在初步監(jiān)測(cè)成分不明的化合物以及其他樣本的AhR配體活性時(shí)，CALUX法無(wú)疑是更好的選擇[25]。

3 熒光素酶表達(dá)基因法在二噁英檢測(cè)中的應(yīng)用

用于二噁英檢測(cè)的CALUX生物檢測(cè)方法，目前可用于檢測(cè)土壤、水、煙氣、污泥、飼料、添加劑以及生物組織中的二噁英、呋喃和多氯聯(lián)苯，該方法已得到美國(guó)(FDA和EPA)、歐盟、智利、日本等國(guó)的廣泛采用，是大量篩查二噁英的新型快速檢測(cè)技術(shù)，并成為部分國(guó)家的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。國(guó)內(nèi)已有研究者利用CALUX技術(shù)對(duì)部分水環(huán)境、沉積物、食品中所含的二噁英進(jìn)行檢測(cè)，但缺乏CALUX技術(shù)在中國(guó)不同水環(huán)境、食品、大氣、土壤、消費(fèi)品、生物樣品中的大量應(yīng)用，缺乏其中所含二噁英的系統(tǒng)調(diào)研，缺乏實(shí)質(zhì)性安全評(píng)估工作的開(kāi)展。并且，當(dāng)前國(guó)內(nèi)二噁英檢測(cè)技術(shù)與發(fā)達(dá)國(guó)家相比尚存在較大差距，CALUX技術(shù)的建立及應(yīng)用可以對(duì)現(xiàn)有化學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行補(bǔ)充，同時(shí)，通過(guò)系統(tǒng)調(diào)研篩查及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)建立二噁英的相應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與規(guī)范，將在一定程度上促進(jìn)二噁英檢測(cè)方法及相應(yīng)質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系的建立和完善。

3.1 熒光素酶表達(dá)基因法用于水環(huán)境中二噁英檢測(cè)

Wang等[26]采用CALUX技術(shù)，對(duì)海河沉積物中的多氯二苯并二噁英和呋喃(PCDD/Fs)，多氯聯(lián)苯(DL)和二噁英類(lèi)多氯聯(lián)苯物質(zhì)(PCBs)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海河沉積物中的PCDD/Fs比DL和PCBs高數(shù)百倍。高水平的二噁英在站點(diǎn)附近流入渤海灣發(fā)現(xiàn)的。二噁英污染可能與鄰近地區(qū)五氯苯酚(PCP)工業(yè)相關(guān)的活動(dòng)有關(guān)。王泰等[27]采用CALUX方法對(duì)海河天津流域底泥中的二噁英污染水平進(jìn)行了調(diào)研，分析了海河底泥中二噁英的分布規(guī)律和污染特征，并且使用HRGC/MS方法進(jìn)行了驗(yàn)證。CALUX TEQ結(jié)果表明海河入?？谔幍奈廴咀顬閲?yán)重，且CALUX得到的TEQ值與HRGC/MS得到的TEQ值之間有很好的相關(guān)性。Murk[28]利用CALUX法檢測(cè)了底泥、水體樣品中的二噁英含量，獲得了良好效果。CALUX作為一種簡(jiǎn)易價(jià)廉的生物分析方法，可以高效快速的應(yīng)用于環(huán)境中沉積物樣品的二噁英分析。TakigamiH等[29]利用CALUX技術(shù)對(duì)大阪灣沉積物樣品中的二噁英類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了分析檢測(cè)，研究結(jié)果表明其中二噁英的含量在3.7～140pg·g-1。張婷婷等[30]采用CALUX法分析北京市污水廠污泥中的二噁英，結(jié)果表明CALUX法可以有效檢出污泥中的二噁英含量，北京市區(qū)現(xiàn)運(yùn)行的九大城市污水處理廠中二噁英的含量較低，未對(duì)環(huán)境造成較大危害。Kima等[31]研究了日本地表水和地下水中二噁英的類(lèi)型及去除效果，在原水和凈化水中二噁英的平均濃度分別為56.45 pg·L-1和4.24 pg·L-1。地下水和凈化后的地下水二噁英含量水平均低于地表水。經(jīng)過(guò)水處理后，二噁英的去除率為87%左右。

3.2 熒光素酶表達(dá)基因法用于食品中二噁英檢測(cè)

目前，CALUX法已被廣泛的用于牛奶、肉類(lèi)、蛋類(lèi)、魚(yú)和魚(yú)油、海產(chǎn)品等食品和動(dòng)物飼料中二噁英類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)[32-33]。Hasegawa等[34]研究了魚(yú)油中PCDFs、DL-PCBs的含量，并同HRGC-HRMS法分析結(jié)果進(jìn)行比較，這些分析驗(yàn)證得出的結(jié)論是 CALUX法和HRGC-HRMS法測(cè)出的TEQ值具有很好的相關(guān)性和一致性，有時(shí) CALUX法還能得到更高的 TEQ值。Chou等[35]利用CALUX法對(duì)牛奶中PCDFs含量進(jìn)行測(cè)定，并且與HRGC-HRMS進(jìn)行了比較，相關(guān)系數(shù)為0.953。Shyu等[36]利用CALUX法研究了臺(tái)灣雞蛋和魚(yú)油樣品中二噁英的含量，含量水平在2.0 ± 0.7 pg·g-1、0.9 ± 0.6 ng·kg-1范圍內(nèi)，均低于歐盟標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 熒光素酶表達(dá)基因法用于生物樣品(母乳、血液)中二噁英檢測(cè)

Croes等[37]利用CALUX法分析了來(lái)自弗蘭德斯地區(qū)的84個(gè)母乳樣品，結(jié)果表明，樣品中PCDFs的含量為10.4 pg·g-1，DL-PCBs 的含量為1.73 pg·L-1。牛穎等[38]利用CALUX法對(duì)大連地區(qū)初產(chǎn)婦乳汁中二噁英含量進(jìn)行了調(diào)研。調(diào)研結(jié)果表明，大連地區(qū)母乳中PCDDs/PCDFs和二噁英總毒性當(dāng)量的中位數(shù)(P50)分別為14.7061和15.8473 pg·g-1。金一和等[17]用CALUX法調(diào)查了我國(guó)沈陽(yáng)(32例)和大連(47例)地區(qū)母乳中二噁英污染水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大連地區(qū)母乳中二噁英污染物總毒性當(dāng)量中位數(shù)為15.95 pg·g-1，而沈陽(yáng)地區(qū)母乳中二噁英污染物總毒性當(dāng)量中位數(shù)僅為7.21 pg·g-1。47例大連地區(qū)母乳樣品中，17例檢出多氯聯(lián)苯(PCB)。我國(guó)大連地區(qū)母乳中二噁英濃度雖然低于日本、美國(guó)、加拿大和德國(guó)，但高于俄羅斯、南非和以色列等國(guó)的平均值[39]。Hui等[40]利用CALUX法測(cè)定了香港人口母乳中二噁英含量水平，檢測(cè)的毒性為13 pg·g-1。Wouwea等[41]利用CALUX法和GC-HRMS法對(duì)人血液樣品中的二噁英類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了測(cè)定，研究表明，CALUX法在人血液樣品中二噁英篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。

3.4 熒光素酶表達(dá)基因法用于土壤(固體廢棄物)中二噁英檢測(cè)

已有文獻(xiàn)表明，CALUX作為一種快速廉價(jià)的生物分析方法，可以用于評(píng)價(jià)受PCBs、氯丹等氯代有機(jī)物污染土壤的光致二噁英類(lèi)活性變化情況。由于其能分開(kāi)檢測(cè)PCDD/Fs和DL-PCBs，因此能夠?yàn)榻沂径f英類(lèi)物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化提供線(xiàn)索，減少進(jìn)一步用HRGC/HRMS分析的工作量[42-43]。李雪等[44]利用CALUX法對(duì)海河流域底泥和土壤中二惡英類(lèi)含量進(jìn)行了測(cè)定研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，海河流域土壤中二噁英的含量(0.55～9.66 pg·g-1)低于底泥中的存在情況(0～322.22 pg·g-1)，DL-PCBs(0～6.13 pg·g-1)的含量低于PCDD/Fs的含量，二噁英含量最高可達(dá)324.15 pg·g-1。并且，不同環(huán)境介質(zhì)嚴(yán)格正確的前處理過(guò)程能夠有效的減少干擾因素對(duì)生物分析過(guò)程的負(fù)面影響，進(jìn)而提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

4 熒光素酶表達(dá)基因法用于二噁英檢測(cè)的研究方向

隨著二噁英檢測(cè)需求的不斷提高，CALUX法用于二噁英的檢測(cè)仍需進(jìn)行深入研究，主要包括樣品前處理改進(jìn)、方法推廣應(yīng)用及標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范的制定等方面。

利用CALUX法進(jìn)行二噁英類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)，當(dāng)前多采用液液萃取法處理樣品，但是存在著處理時(shí)間長(zhǎng)、有機(jī)試劑消耗多，易造成二次污染的劣勢(shì)，可結(jié)合更簡(jiǎn)單、便捷的固相萃取技術(shù)從而實(shí)現(xiàn)液液萃取前處理的替代。

當(dāng)前，CALUX法在國(guó)內(nèi)的應(yīng)用并不普遍，中科院環(huán)境所等少數(shù)單位采用HRGC/HRMS法進(jìn)行二噁英的分析檢測(cè)工作，所檢測(cè)的二噁英物質(zhì)的種類(lèi)、數(shù)量和范圍有限。因此，中國(guó)尚缺乏有關(guān)環(huán)境和食品中二噁英污染狀況調(diào)查資料，且無(wú)法估算不同途徑對(duì)二噁英總攝入量的貢獻(xiàn)率。未來(lái)非常有必要加快CALUX法的推廣步伐，利用該法進(jìn)行廣泛的二英污染狀況調(diào)查，并開(kāi)展相應(yīng)的健康危害評(píng)價(jià)。

此外，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)尚未制定二噁英的國(guó)家檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，亟需建立一套符合中國(guó)國(guó)情的低成本、快速簡(jiǎn)便的二噁英檢測(cè)體系，以解決二噁英檢測(cè)能力嚴(yán)重不足的問(wèn)題，從而對(duì)我國(guó)二噁英的研究和污染防治工作起到積極作用。

綜上所述，二噁英的物理性質(zhì)決定了僅用一種方法不能達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)的目的。CALUX技術(shù)作為一種新興的生物檢測(cè)技術(shù)，已被認(rèn)為是用于快速篩選和檢測(cè)食品、大氣、各種生物樣品、環(huán)境樣品中二噁英類(lèi)物質(zhì)的最好方法，也是唯一可以大規(guī)模常規(guī)快速篩選二噁英類(lèi)物質(zhì)的方法，具有廣闊的發(fā)展前景和較大優(yōu)勢(shì)。該法雖然不能檢測(cè)二噁英的各組分含量，但它簡(jiǎn)便、快速、低廉、特異性高，并且能更準(zhǔn)確的反映二噁英對(duì)機(jī)體的影響。由于二噁英對(duì)細(xì)胞芳香烴受體的聯(lián)合作用不僅僅是單純的相加作用，還存在協(xié)同和拮抗作用，因此，CALUX法不但可以測(cè)定環(huán)境樣品中二噁英的總含量，還可以檢測(cè)所有二噁英類(lèi)物質(zhì)對(duì)活體細(xì)胞產(chǎn)生的生物效應(yīng)，同時(shí)還能用于分析和發(fā)現(xiàn)對(duì)人體健康有害的新的污染物[32]。實(shí)際應(yīng)用中，可先用 CALUX法對(duì)污染樣品進(jìn)行篩選，作初步定性檢測(cè)，再將篩選出的陽(yáng)性樣品用GC/MS法和HRGC/HRMS法作進(jìn)一步精確的定性定量分析。因此，CALUX法是化學(xué)分析法的有效補(bǔ)充，可以更合理、完善的評(píng)估環(huán)境及食品樣品中二噁英的影響，并大大的節(jié)約時(shí)間和分析費(fèi)用。

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