徐曉雪，郭鳳，王千慧，張朝東，楊軍，趙久晗，蔡際群

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.神經(jīng)病學(xué)研究所；3.藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽110001）

神經(jīng)肽Y及其Y1受體在遺傳性癲癇大鼠腦內(nèi)的表達(dá)及意義

徐曉雪1，2，郭鳳3，王千慧3，張朝東1，2，楊軍1，2，趙久晗1，2，蔡際群3

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；2.神經(jīng)病學(xué)研究所；3.藥學(xué)院藥物毒理教研室，沈陽110001）

目的探討遺傳性癲癇大鼠（TRM）海馬和顳葉皮質(zhì)中神經(jīng)肽Y（NPY）及其Y1受體（Y1R）的表達(dá)和分布。方法逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測NPY和Y1RmRNA表達(dá)。ELISA試劑盒法檢測TRM和Wistar大鼠海馬和顳葉皮質(zhì)中NPY濃度。Western blot檢測Y1R蛋白表達(dá)。免疫熒光雙標(biāo)記法分析TRM及Wistar大鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)以及顳葉皮質(zhì)中NPY與Y1R的分布和共定位。結(jié)果ELISA和RT-PCR結(jié)果均顯示，TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中NPY表達(dá)明顯上調(diào)，與Wistar大鼠比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。Western blot結(jié)果證實，TRM海馬中Y1R蛋白表達(dá)明顯低于Wistar大鼠，而在顳葉皮質(zhì)中顯著高于Wistar大鼠。免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)NPY與Y1R在TRM海馬CA1、CA3區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞和DG區(qū)顆粒細(xì)胞以及顳葉皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞中分布廣泛，并存在共定位且主要定位在細(xì)胞膜上。結(jié)論在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中，NPY及其Y1R表達(dá)出現(xiàn)異常變化，而這種異常表達(dá)可能與TRM癲癇發(fā)生機(jī)制有關(guān)。

癲癇；神經(jīng)肽Y；Y1受體；亞型；海馬；顳葉皮質(zhì)

癲癇是一種以大腦神經(jīng)元異常放電為特征的神經(jīng)系統(tǒng)常見疾?。?］，其發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，至今沒有完全闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)誘發(fā)癲癇發(fā)病的主要因素除了與神經(jīng)元興奮性異常增高有關(guān)，還可能與機(jī)體自身缺乏有效的抑制性神經(jīng)信息傳遞有密切聯(lián)系。神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）是由36個氨基酸構(gòu)成的一種活性多肽。由Lund berg等［2］于1982年首次從豬腦中提取，在哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NPY是含量最豐富的多肽之一。由于其在海馬結(jié)構(gòu)中濃度最高，并且能夠與經(jīng)典的抑制性氨基酸γ-氨基丁酸共存，因此NPY被認(rèn)為是一種內(nèi)源抑制性神經(jīng)肽，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性［3］。Y1受體（Y1 receptor，Y1R）是重要的NPY受體亞型，屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族，廣泛分布在海馬、皮質(zhì)等部位的中間神經(jīng)元中。在紅藻氨酸致癇模型中，NPY與Y1R結(jié)合后，可以通過G蛋白降低神經(jīng)元興奮性［4］。而在不同的致癇模型中，NPY及其Y1R的表達(dá)和功能也可能有差異。

由日本京都大學(xué)首次發(fā)現(xiàn)的遺傳性癲癇大鼠（Tremor rat，TRM）在10號染色體上存在Tm基因突變，出生8周后無需外加物理化學(xué)因素刺激而出現(xiàn)自發(fā)性抽搐以及失神樣的癲癇發(fā)作，是研究癲癇小發(fā)作的理想模型［5，6］。目前關(guān)于TRM腦內(nèi)NPY及其受體的表達(dá)變化未見報道。因此，本研究擬利用分子生物學(xué)檢測方法探討NPY及其Y1R在TRM癲癇發(fā)生中的作用，為進(jìn)一步開發(fā)抗遺傳性癲癇特異性藥物和基因治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

日本京都大學(xué)饋贈TRM種鼠，由中國醫(yī)科大學(xué)自行繁殖；健康Wistar大鼠由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供。模型組TRM和對照組Wistar大鼠均為9～12周齡，雌雄不限，在每項實驗中各8只。TRIzol購自美國Sigma公司，NPY、Y1R和GAPDH引物由TaKaRa公司合成，ELISA試劑盒購于武漢優(yōu)爾生公司，一抗NPY小鼠單克隆抗體和Y1R兔多克隆抗體購自美國ABCAM公司，一抗GAPDH小鼠單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測NPY與Y1RmRNA水平表達(dá)

TRM和Wistar大鼠麻醉后斷頭，迅速取出全腦，剝離海馬和顳葉皮質(zhì)，參照TRIzol說明書提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。取1 μg總RNA樣本模板于10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，參照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒操作。反應(yīng)條件為37℃反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 s，反應(yīng)體積為25 μL。采用GAPDH為內(nèi)參，反應(yīng)條件為95℃反應(yīng)45 s，60℃反應(yīng)50 s，72℃反應(yīng)90 s，72℃反應(yīng)5 min，共30個循環(huán)。陰性對照模板為ddH2O，其余體系組分以及反應(yīng)條件均與實驗組相同。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后分析比對灰度值。以NPY和Y1R與GAPDH灰度值的比值為mRNA相對表達(dá)量。各目的基因PCR反應(yīng)引物序列：NPY：上游5′-TAGGT AACAAACGAATGGGG-3′，下游5′-AGGATGAGAT GAGATGTGGG-3′；Y1R：上游5′-CGTTAGGCCATT CACAAGAATGAAG-3′，下游5′-ATGCTCTGATGAG CGATGCAA-3′；GAPDH：上游5′-GGCACAGTCAAG GCTGAGAATG-3′，下游5′-ATGGTGGTGAAGACGC CAGTA-3′。

1.3 ELISA試劑盒檢測NPY蛋白濃度

乙醚麻醉TRM和Wistar大鼠，斷頭取腦后快速分離海馬和顳葉皮質(zhì)。提取總蛋白并測濃度，將所用樣品濃度統(tǒng)一稀釋到3 μg/μL。其余步驟按照ELISA試劑盒說明書操作。所有試劑盒內(nèi)試劑和樣品室溫平衡30 min。在確保酶標(biāo)板板底無水滴和孔內(nèi)無氣泡后，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長測量各孔的光密度值。

1.4 Western blot檢測Y1R蛋白水平表達(dá)

將剝離的海馬和顳葉皮質(zhì)加入RIPA裂解液以及蛋白酶抑制劑混合物，勻漿超聲后低溫離心取上清液，提取樣本總蛋白用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性后取60 μg/孔，5%濃縮膠和12%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓80 V 60 min，分離膠電壓120 V 80 min。之后轉(zhuǎn)印至PVDF膜（200 mA，1.5 h）。5%BSA常溫封閉1 h后分別加入一抗Y1R（1∶500）和GAPDH（1∶1 500），4℃過夜孵育。次日TBST洗膜后，加入相應(yīng)的二抗（羊抗兔1∶3 000，羊抗小鼠1∶3 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜后ECL化學(xué)發(fā)光，測定分析灰度值，將Y1R與GAPDH灰度值的比值作為蛋白相對表達(dá)量。

1.5 免疫熒光雙標(biāo)記染色檢測NPY與Y1R分布

TRM和Wistar大鼠麻醉后，4%多聚甲醛心臟灌流，迅速取腦，4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖沉糖24 h OCT復(fù)合物包埋，冰凍切片機(jī)進(jìn)行10 μm厚的連續(xù)冠狀切片。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次10 min，1%正常牛血清蛋白及0.2%Triton X-100孵育90 min，分別加入兔抗Y1R（1∶50）和小鼠抗NPY一抗（1∶40）混合物，4℃濕盒過夜。次日PBS清洗，在暗室中加入FITC標(biāo)記羊抗兔（1∶200）和Cy3標(biāo)記羊抗小鼠（1∶200）二抗混合物，避光孵育2 h后加入DAPI（1∶500）標(biāo)記細(xì)胞核并封片。400倍熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)。陰性對照一抗由PBS代替，其余步驟均相同。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 NPY在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中表達(dá)上調(diào)

利用RT-PCR檢測NPY在TRM腦內(nèi)mRNA水平表達(dá)，如圖1結(jié)果顯示，NPY在TRM和Wistar大鼠中的相對灰度值海馬分別為0.76±0.10和0.43±0.08，顳葉皮質(zhì)分別為0.74±0.08和0.49±0.10。說明相較于Wistar大鼠，TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中NPYmRNA相對表達(dá)量出現(xiàn)顯著上調(diào)（均P＜0.01）。

由于NPY的分子量很小，因此選擇ELISA試劑盒分析NPY在TRM腦內(nèi)的蛋白濃度，結(jié)果顯示，TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中的NPY含量分別為（56.93±3.77）和（48.12±3.13）pg/mL，Wistar大鼠分別為（23.18±2.15）和（19.17±2.32）pg/mL，TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中的NPY含量均比Wistar大鼠相應(yīng)部位含量多（均P＜0.01）。與RT-PCR實驗結(jié)論基本一致。

2.2 Y1R在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中表達(dá)異常

RT-PCR檢測TRM腦內(nèi)Y1RmRNA水平表達(dá)。如圖1顯示，在TRM和Wistar大鼠海馬中，Y1RmRNA表達(dá)相對灰度值分別為0.52±0.12和0.90± 0.12，而在顳葉皮質(zhì)中分別為0.91±0.08和0.59± 0.11。說明相較于Wistar大鼠，Y1RmRNA水平表達(dá)在TRM海馬中顯著降低，而在其顳葉皮質(zhì)中則明顯增高（均P＜0.01）。

圖1 RT-PCR檢測NPY和Y1R在各組大鼠腦內(nèi)的表達(dá)Fig.1 The mRNA expression of NPY and Y1R in TRM and Wistar brain subareas detected by RT-PCR

圖2 Western blot檢測Y1R在各組大鼠腦內(nèi)的蛋白表達(dá)Fig.2 The protein expression of Y1R detected by Western blot in TRM and Wistar brain subareas

Western blot檢測TRM腦內(nèi)Y1R蛋白水平表達(dá)。如圖2顯示，TRM海馬和顳葉皮質(zhì)中Y1R蛋白表達(dá)相對灰度值分別為0.50±0.06和0.49±0.04，而Wistar大鼠分別為0.79±0.08和0.35±0.04，說明相較于Wistar大鼠，Y1R蛋白水平表達(dá)在TRM海馬中明顯下降，而在其顳葉皮質(zhì)中則顯著升高（均P＜0.01）。進(jìn)一步驗證了RT-PCR實驗結(jié)論。

2.3 免疫熒光雙標(biāo)記法檢測TRM腦內(nèi)NPY與Y1R分布

免疫熒光檢測了NPY和Y1R在TRM腦內(nèi)的分布以及共定位情況。如圖3顯示，NPY和Y1R在TRM海馬CA1、CA3、DG區(qū)以及顳葉皮質(zhì)區(qū)都有廣泛的分布和共定位，包括CA1和CA3錐體細(xì)胞層以及DG區(qū)的顆粒細(xì)胞層。其中Y1R主要定位在細(xì)胞膜以及神經(jīng)元部分軸突上。通過統(tǒng)計100個細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)我們發(fā)現(xiàn)，相較于Wistar大鼠，Y1R與NPY共定位的陽性細(xì)胞在TRM海馬CA1和CA3數(shù)量顯著減少，在DG的數(shù)量無明顯變化，但是在顳葉皮質(zhì)區(qū)數(shù)量增多，見表1。

表1 TRM腦內(nèi)不同部位中NPY與Y1R共定位陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計Tab.1 The number of positive cells with co-localized NPY and Y1R in TRM brain subareas

3 討論

本研究的主要目的是研究NPY和Y1R在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)的表達(dá)和分布。我們首次發(fā)現(xiàn)相較于正常Wistar大鼠，NPY在TRM海馬以及顳葉皮質(zhì)中表達(dá)異常增加，Y1R在TRM海馬中表達(dá)明顯減少，而在顳葉皮質(zhì)中表達(dá)顯著上調(diào)。免疫熒光雙標(biāo)記檢測結(jié)果也證實，NPY和Y1R在TRM海馬CA1、CA3和DG以及顳葉皮質(zhì)區(qū)域都有廣泛的分布和共定位。

作為一種突觸前抑制劑，NPY能夠通過抑制谷氨酸的釋放來調(diào)控神經(jīng)元興奮性。因此當(dāng)癲癇發(fā)作造成神經(jīng)元損傷時，NPY介導(dǎo)的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)功能可能被啟動。在紅藻氨酸注射誘導(dǎo)致癇的大鼠模型中，在海馬中間神經(jīng)元能夠觀察到NPY表達(dá)的持續(xù)增加［7，8］。這與我們的實驗結(jié)果基本一致。Mao等［9］前期研究發(fā)現(xiàn)TRM腦內(nèi)谷氨酸和γ-氨基丁酸濃度失衡。因此推測，NPY的異常表達(dá)增加可能是機(jī)體內(nèi)源性的保護(hù)作用。目前，已有相關(guān)報道通過外源性注射NPY以及利用腺病毒攜帶人工高表達(dá)NPY基因的質(zhì)粒都能夠達(dá)到抗癲癇的功效［10，11］，進(jìn)一步驗證了NPY對于癲癇治療的重要價值。

圖3 免疫熒光染色檢測NPY與Y1R在TRM腦內(nèi)的分布與定位×400Fig.3 The co-localizations of NPY and Y1R in TRM and Wistar brains by double-labeled immunofluorescence staining×400

癲癇誘發(fā)的NPY異常表達(dá)與NPY受體的表達(dá)變化有密切關(guān)系。Y1R是大量存在于海馬和顳葉皮質(zhì)突觸后神經(jīng)元上的受體［12］，對維持機(jī)體內(nèi)部的能量環(huán)路平衡發(fā)揮重要作用。Husum等［13］認(rèn)為，在電休克致癇模型中阻礙Y1R的活性可抑制細(xì)胞內(nèi)NPY的釋放。但是由于Y1R在不同致癇模型中表達(dá)變化有差異，因此其在癲癇發(fā)生中扮演的角色一直存在爭議。例如在癲癇患者發(fā)作后，有研究發(fā)現(xiàn)其顆粒細(xì)胞層中的Y1R表達(dá)急劇下降以及Y1R陽性神經(jīng)元的缺失與損傷。這與我們在TRM海馬中觀察到的結(jié)果類似。但是在Noda癲癇大鼠中，Y1R在海馬中的表達(dá)卻出現(xiàn)明顯增加［14］。還有體內(nèi)試驗認(rèn)為NPY能夠通過Y1R的作用增加谷氨酸的釋放，但并不影響或阻礙其抗癲癇功能［15］。這說明不同的癲癇模型中Y1R的表達(dá)變化可能不一致，再一次驗證了癲癇發(fā)生機(jī)制的復(fù)雜性。我們推測，TRM海馬中Y1R表達(dá)減少可能有助于NPY神經(jīng)保護(hù)功能的啟動和發(fā)揮，而其在顳葉皮質(zhì)中的表達(dá)增加則有可能是機(jī)體的一種代償作用。

綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)與正常Wistar大鼠相比，NPY在TRM海馬和顳葉皮質(zhì)部位表達(dá)明顯增加；Y1R在TRM海馬表達(dá)下調(diào)，而在顳葉皮質(zhì)中表達(dá)上調(diào)。TRM腦內(nèi)NPY介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)功能可能沒有受到損傷并正常啟動。而Y1R的異常表達(dá)可能有助于NPY發(fā)揮抗癲癇作用。但是這種保護(hù)沒有完全抵御TRM癲癇的發(fā)生。這可能是由于NPY表達(dá)量仍然不足，也有可能是其他關(guān)鍵蛋白例如蛋白激酶C的異常表達(dá)阻礙了NPY抑制興奮性氨基酸釋放的功能。但是無論哪種推測都需要進(jìn)一步驗證。

［1］郭鳳，姚陽，孫威，等.無鎂誘導(dǎo)培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元與SH-SY5Y細(xì)胞自發(fā)性放電的變化［J］.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，41（7）：577-579.

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（編輯 陳姜）

Expressionsand Co-localizationsofNeuropeptide Y and Y1 Receptor in Brain ofTremor Rats

XUXiao-xue1，2，GUOFeng3，WANGQian-hui3，ZHANGChao-dong1，2，YANGJun1，2，ZHAOJiu-han1，2，CAIJi-qun3
（1.Department of Neurology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Institute of Neurology，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.DepartmentofPharmaceuticalToxicology，SchoolofPharmacy，China MedicalUniversity，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo explore the expression and distribution of neuropeptide Y（NPY）and Y1 receptor（Y1R）in brain of Tremor rats（TRM）.MethodsThe mRNA expression ofNPYandY1Rwas detected by RT-PCR.The concentration of NPY was detected by ELISA kit.The protein expression of Y1R was determined by Western blot in TRM hippocampus and temporal lobe cortex.The distribution and co-localization of these two proteins were analyzed using double-labeling immunofluorescence staining in temporal lobe cortex and hippocampal CA1，CA3，and DG.ResultsCompared with Wistar rats，increased NPY and decreased Y1R were observed in the hippocampus of TRM.However，both NPY and Y1R were up-regulated in TRM temporal lobe cortex.NPY and Y1R were present and co-localized throughout TRM brains，especially localized on the membranes of pyramidal cells and granule cells.ConclusionThe altered expressions of NPY and Y1R were observed in TRM hippocampus and temporallobe cortex，which may be involved in the generation ofTRMepileptiform activity.

epilepsy；neuropeptide Y；Y1 receptor；subtype；hippocampus；temporal lobe cortex

R742.1

A

0258-4646（2014）09-0794-05

國家自然青年科學(xué)基金（81001429）

徐曉雪（1983-），女，助理研究員，博士. E-mail：xiaoxue80cn@sina.com

2014-06-23

網(wǎng)絡(luò)出版時間：