時(shí)麗平 孫秀威

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院門(mén)診化療科(150040)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer, CRC)是目前最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，大量證據(jù)表明CRC的發(fā)生、發(fā)展與機(jī)體免疫狀態(tài)有關(guān)。惡性腫瘤是宿主體內(nèi)一群能不斷表達(dá)正常抗原(基因過(guò)度表達(dá))和(或)異?？乖?基因修飾、突變或缺失)的自身組織細(xì)胞[1]。機(jī)體免疫系統(tǒng)可通過(guò)腫瘤免疫識(shí)別腫瘤，但并不一定能有效激發(fā)抗腫瘤免疫反應(yīng)，說(shuō)明腫瘤的發(fā)生既與基因調(diào)控異常有關(guān)，亦與機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)失調(diào)存在一定的聯(lián)系。自1995年Sakaguchi等[2]首次報(bào)道調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg細(xì)胞)以來(lái)，其腫瘤免疫的作用備受學(xué)者關(guān)注。Treg細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的表達(dá)可抑制識(shí)別了自身腫瘤細(xì)胞的免疫效應(yīng)細(xì)胞的發(fā)育和活化，可能是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的因素之一，避免腫瘤殺傷，從而促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)Foxp3(forkhead box P3)屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是調(diào)控Treg細(xì)胞發(fā)育和功能效應(yīng)的關(guān)鍵因素，亦是Treg細(xì)胞較可靠的標(biāo)記[3]。已有研究[4]顯示，CRC患者腫瘤組織中Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)目顯著高于癌旁未受腫瘤侵犯的黏膜層。本文就Foxp3+Treg細(xì)胞的主要特征、功能、可能的作用機(jī)制及其與CRC臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系作一闡述。

一、Treg細(xì)胞概述

1. Treg細(xì)胞的主要特征：Treg細(xì)胞以表面高水平表達(dá)CD25、CD4、CD103、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4(CTLA-4)、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(GITR)和神經(jīng)纖毛蛋白-1(Nrp-1)，低水平表達(dá)細(xì)胞表面分子CD127[5]為主要特征。并非所有CD4+CD25+T細(xì)胞均為T(mén)reg細(xì)胞，僅CD25高水平表達(dá)的細(xì)胞才是Treg細(xì)胞，這類(lèi)細(xì)胞應(yīng)具備FOXP3表達(dá)或CD127-的特點(diǎn)。Foxp3是Treg細(xì)胞關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記，對(duì)Treg細(xì)胞的分化、發(fā)育和免疫調(diào)節(jié)功能的發(fā)揮具有重要作用[6]。人Foxp3基因定位于X染色體，是具有共同高度保守序列“叉狀頭/翅膀狀螺旋” DNA結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子forkhead/winged-helix家族成員之一，通過(guò)該結(jié)構(gòu)域與DNA特定位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)節(jié)目的基因的活化和表達(dá)。Foxp3除含有forkhead結(jié)構(gòu)域外，其轉(zhuǎn)錄抑制部位位于N末端區(qū)域，其后還含有一個(gè)C2N2鋅指結(jié)構(gòu)和亮氨酸拉鏈。Foxp3的N末端轉(zhuǎn)錄抑制性區(qū)域是轉(zhuǎn)錄因子的特異性功能區(qū)域，或許對(duì)Treg細(xì)胞的生理功能發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，目前Foxp3具體的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。

2. Treg細(xì)胞的功能特性：Treg細(xì)胞具有兩大功能特性，分別為免疫無(wú)能性和免疫抑制性。免疫無(wú)能性表現(xiàn)為T(mén)reg細(xì)胞對(duì)高密度白細(xì)胞介素(IL)-2單獨(dú)刺激、固相包被或可溶性CD3單抗以及CD3和CD8單抗聯(lián)合作用均無(wú)應(yīng)答，且Treg細(xì)胞本身不分泌IL-2；免疫抑制性表現(xiàn)為活化的Treg細(xì)胞可經(jīng)多種途徑非特異性抑制T細(xì)胞的活化和增殖，即對(duì)CD4+和CD8+T細(xì)胞等均有抑制作用。

3. Treg細(xì)胞對(duì)腫瘤免疫抑制作用的機(jī)制：腫瘤患者中Treg細(xì)胞升高的具體機(jī)制目前尚不十分明確，是Treg細(xì)胞升高導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，抑或是腫瘤微環(huán)境使Treg細(xì)胞募集的問(wèn)題，還有待進(jìn)一步探索。

Treg細(xì)胞可通過(guò)分泌抑制性細(xì)胞因子和表面分子與目標(biāo)細(xì)胞接觸兩種途徑發(fā)揮抗腫瘤的免疫抑制效應(yīng)。①Treg細(xì)胞可分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β、IL-10、顆粒酶等細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮免疫抑制功能。TGF-β對(duì)機(jī)體多種免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(natural killer cell, NK細(xì)胞)、樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的生長(zhǎng)、發(fā)育均有重要調(diào)節(jié)作用。有研究表明TGF-β能抑制淋巴細(xì)胞增殖，抑制巨噬細(xì)胞的活化[7-8]。IL-10是Treg細(xì)胞分泌的具有免疫抑制作用的細(xì)胞因子，Strauss等[9]對(duì)頭頸鱗癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10能明顯拮抗機(jī)體抗腫瘤的免疫反應(yīng)。IL-10可明顯降低抗原特異性T細(xì)胞增殖，還可使樹(shù)突細(xì)胞表面CD40、CD80和CD86等共刺激分子表達(dá)下調(diào)，從而使樹(shù)突細(xì)胞呈遞的抗原利于Treg細(xì)胞的誘導(dǎo)活化，而不利于效應(yīng)T細(xì)胞誘導(dǎo)。顆粒酶是一種絲氨酸蛋白酶，活化的Treg細(xì)胞可通過(guò)分泌顆粒酶A通過(guò)穿孔素途徑引起T細(xì)胞、單核細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞凋亡。②Treg細(xì)胞表面的CTLA-4與目標(biāo)細(xì)胞如T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的B7配體結(jié)合后可抑制目標(biāo)細(xì)胞的活化增殖，并可通過(guò)B7/CTLA-4作用于抗原呈遞細(xì)胞(antigen presenting cell, APC)，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性。誘導(dǎo)荷瘤小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞的CTLA-4缺失，可誘發(fā)顯著的抗腫瘤免疫效應(yīng)，引起腫瘤消退[10]。此外，Treg細(xì)胞可通過(guò)CD25競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IL-2從而抑制效應(yīng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的功能[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞還可通過(guò)調(diào)節(jié)核因子κB受體激活因子的配體(receptor or activator of NF-κB ligand, RANKL)信號(hào)來(lái)促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[12]。

二、Foxp3+Treg細(xì)胞與腫瘤免疫調(diào)節(jié)

1. 腫瘤微環(huán)境中Foxp3+Treg細(xì)胞的變化：Woo等[13]首次報(bào)道了Foxp3+Treg細(xì)胞在非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和卵巢癌相關(guān)淋巴細(xì)胞中的比例上調(diào)，并可分泌細(xì)胞因子TGF-β和IL-10，抑制T細(xì)胞的活化和增殖。隨后的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在頭頸癌、乳腺癌、肝細(xì)胞癌、胃腸腫瘤、胰腺癌、前列腺癌等多種實(shí)體瘤患者中，外周血淋巴細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中均可見(jiàn)Treg細(xì)胞比例、數(shù)目增高。表明惡性腫瘤患者體內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞上調(diào)是一種普遍現(xiàn)象，可能對(duì)腫瘤的自身免疫發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能。腫瘤患者外周血和腫瘤局部Treg細(xì)胞數(shù)量增加及其在淋巴細(xì)胞中比例上調(diào)的可能原因?yàn)槟[瘤誘導(dǎo)Treg細(xì)胞增殖以及腫瘤誘導(dǎo)Treg細(xì)胞聚集。但Foxp3+Treg細(xì)胞在腫瘤局部的表達(dá)頻率因腫瘤類(lèi)型、疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)不同而有所不同[14]。Du等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌腫瘤微環(huán)境中人白細(xì)胞抗原-G可通過(guò)上調(diào)Treg細(xì)胞進(jìn)行免疫逃逸，同時(shí)腫瘤細(xì)胞作為自身抗原在局部微環(huán)境中的持續(xù)刺激可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的生成。此外，腫瘤微環(huán)境可分泌多種趨化因子(如CCL22)，這些趨化因子與Treg細(xì)胞表面受體結(jié)合后可募集Treg細(xì)胞至腫瘤部位發(fā)揮免疫抑制作用[16]。

2. Foxp3+Treg細(xì)胞與腫瘤發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系：Liyanage等[17]的研究表明Treg細(xì)胞對(duì)免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤免疫反應(yīng)有一定的抑制作用，去除Treg細(xì)胞后可提高活化效應(yīng)細(xì)胞的免疫殺傷功能。Foxp3可能通過(guò)影響Treg細(xì)胞的發(fā)育來(lái)對(duì)其進(jìn)行功能調(diào)節(jié)。但最近一項(xiàng)系統(tǒng)性研究[18]發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxp3+Treg細(xì)胞與部分腫瘤如結(jié)直腸癌的良好預(yù)后相關(guān)。該研究對(duì)Foxp3+Treg細(xì)胞與腫瘤位置、腫瘤細(xì)胞的分子類(lèi)型、腫瘤分期、分化程度等多種因素的關(guān)系進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示Treg細(xì)胞對(duì)腫瘤預(yù)后的影響可能不僅僅依賴(lài)于數(shù)量和功能，同時(shí)還依賴(lài)于其在淋巴細(xì)胞中的比例、特異性解剖學(xué)定位甚至是局部組織分布。有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)定位模式而非檢測(cè)Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量可預(yù)測(cè)胃癌患者的生存期[19]；Foxp3+Treg細(xì)胞/粒酶B細(xì)胞比值可預(yù)測(cè)霍奇金淋巴瘤患者的預(yù)后[20]；Foxp3+Treg細(xì)胞對(duì)ER陽(yáng)性的乳腺癌患者預(yù)后具有一定評(píng)估作用，而對(duì)ER陰性乳腺癌患者則不然[21]。上述研究結(jié)果說(shuō)明在不同類(lèi)型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中Treg細(xì)胞可能起不同的作用。Foxp3+Treg細(xì)胞與腫瘤預(yù)后關(guān)系的結(jié)果不一，可能還與研究所采用的技術(shù)、抗體、評(píng)分策略以及統(tǒng)計(jì)學(xué)方法的差異有關(guān)[18]。

三、Foxp3+Treg細(xì)胞與CRC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系

近年隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展、基因測(cè)序以及分子診斷水平的提高，不斷發(fā)現(xiàn)新的CRC預(yù)后因子，F(xiàn)oxp3+Treg細(xì)胞是繼K-ras后對(duì)CRC預(yù)后判斷具有潛在意義的分子標(biāo)記物之一，可能成為一項(xiàng)CRC的獨(dú)立預(yù)后評(píng)估指標(biāo)[22]。雖然目前已證實(shí)Foxp3+Treg細(xì)胞在CRC患者腫瘤組織和外周血中的表達(dá)均高于正常人，但Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系仍有爭(zhēng)議。

1. Foxp3+Treg細(xì)胞與CRC臨床病理特征的關(guān)系：Ling等[23]的研究表明，晚期CRC患者外周血和腫瘤局部的Treg細(xì)胞數(shù)量均高于早期患者。蓋曉東等[24]的研究通過(guò)免疫組化法檢測(cè)CRC組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)和分布，結(jié)果顯示CRC患者腫瘤組織中Foxp3蛋白表達(dá)水平顯著升高，與癌旁組織相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；中低分化組Treg細(xì)胞數(shù)量明顯高于高分化組(P<0.01)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P<0.05)；無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組明顯高于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組(P<0.01)；Treg細(xì)胞數(shù)量與癌巢內(nèi)CD4+/CD8+比值呈顯著負(fù)相關(guān)。表明Treg細(xì)胞在CRC腫瘤免疫中扮演重要角色，可能影響了腫瘤的分化，促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。

2. Foxp3+Treg細(xì)胞與CRC預(yù)后的關(guān)系：Salama等[14]的研究對(duì)967例Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)水平明顯提高，但Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量增加的患者生存期反而延長(zhǎng)，這與其在已報(bào)道的多種實(shí)體瘤，包括黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、肝細(xì)胞癌和胰腺癌中的作用相餑。此外，該研究首次報(bào)道了CRC患者癌旁正常組織Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量升高預(yù)示預(yù)后差，與腫瘤組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的作用相反。Sinicrope等[25]的研究顯示Treg細(xì)胞比例升高與CRC患者較短的生存時(shí)間相關(guān)，提示Treg細(xì)胞比例對(duì)CRC的預(yù)后有重要作用，檢測(cè)腫瘤微環(huán)境中Foxp3+Treg細(xì)胞可能對(duì)CRC患者的預(yù)后有指導(dǎo)作用。此外，Betts等[26]的研究顯示，CRC患者具有較高的Treg細(xì)胞水平，同時(shí)伴隨CD4+T細(xì)胞對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的抑制作用減弱，抗腫瘤免疫作用的減弱導(dǎo)致術(shù)后患者在一年內(nèi)復(fù)發(fā)，說(shuō)明Treg細(xì)胞有助于CRC的進(jìn)展。Katz等[27]對(duì)188例結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者腫瘤浸潤(rùn)性T細(xì)胞與預(yù)后的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果表明Foxp3/CD4和Foxp3/CD8比例升高是結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者總體生存期(OS)明顯縮短的獨(dú)立預(yù)后因素。Suzuki等[28]的研究表明Foxp3+VEGFR2+Treg細(xì)胞是CRC患者無(wú)病生存期(disease free survival, DFS)和OS的獨(dú)立預(yù)后因素，而Foxp3+Treg細(xì)胞和Foxp3+VEGFR2-Treg細(xì)胞與DFS和OS無(wú)關(guān)。Kim等[29]的最新研究首次報(bào)道了Foxp3在CRC腫瘤細(xì)胞而非腫瘤浸潤(rùn)的Treg細(xì)胞中的表達(dá)與CRC患者疾病進(jìn)展有關(guān)。該研究應(yīng)用基因和蛋白分析法檢測(cè)了CRC患者Treg細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中Foxp3高表達(dá)者預(yù)后更差，而Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)差異對(duì)患者的預(yù)后無(wú)明顯影響。Yoon等[30]提出Foxp3+Treg細(xì)胞密度在CRC腫瘤基質(zhì)和腫瘤上皮細(xì)胞中相似，但其對(duì)預(yù)后的影響與CD8+T細(xì)胞密度有關(guān)，F(xiàn)oxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量升高僅在低密度CD8+T細(xì)胞環(huán)境中預(yù)示較好的預(yù)后，而在高密度CD8+T細(xì)胞環(huán)境中無(wú)預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值，認(rèn)為低細(xì)胞毒性的免疫微環(huán)境有利于Foxp3+Treg細(xì)胞發(fā)揮積極的預(yù)后價(jià)值。Frey等[31]的研究對(duì)142例CRC患者行錯(cuò)配修復(fù)(mismatch-repair, MMR)基因狀態(tài)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)性Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量升高可改善無(wú)MMR基因缺陷的CRC患者預(yù)后。

四、展望

Treg細(xì)胞的研究使人類(lèi)對(duì)于腫瘤免疫和免疫逃逸機(jī)制的認(rèn)識(shí)進(jìn)一步豐富，同時(shí)為以往多種腫瘤免疫治療療效不佳提出新的解釋?zhuān)瑸槟[瘤免疫治療方面的應(yīng)用提供了新思路。多項(xiàng)研究證實(shí)，CRC組織中Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)明顯高于正常組織，但Foxp3+Treg細(xì)胞與CRC患者預(yù)后的關(guān)系受多種因素的影響，包括Foxp3：CD4和Foxp3：CD8比例、MSI基因狀態(tài)、腫瘤的位置、腫瘤細(xì)胞的分子類(lèi)型、腫瘤的分期、分化程度等。因此，應(yīng)更深入了解Treg細(xì)胞的特性，不斷探索Treg細(xì)胞與腫瘤相互作用機(jī)制及其與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系，采取新技術(shù)對(duì)Treg細(xì)胞亞型進(jìn)一步細(xì)化，從而為更好地檢測(cè)、治療腫瘤提供新思路，為腫瘤免疫治療取得新的突破提供更可靠的理論依據(jù)。此外，F(xiàn)oxp3的表達(dá)和功能不能再被認(rèn)為僅限于T細(xì)胞，在多種不同組織來(lái)源的癌細(xì)胞如CRC細(xì)胞中亦表達(dá)，可能在生物體內(nèi)發(fā)揮更廣泛的功能[29]。因此，抑制腫瘤相關(guān)性Treg 細(xì)胞中的Foxp3表達(dá)和功能，以達(dá)到抗腫瘤目的的治療方法值得進(jìn)一步綜合研究。

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