張毅強(qiáng) 師帥帥 郭改娥 裴晉紅 汪軍梅 蘇 嬌 (長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，長(zhǎng)治 046000)

前列腺源性轉(zhuǎn)錄因子(Prostate-derived Ets factor，PDEF)是Libermann［1］在前列腺特異性抗原基因中發(fā)現(xiàn)的ETS(E-twenty-six transformation specific)家族轉(zhuǎn)錄因子［2］。ETS 因子正常存在于細(xì)胞的一些生理和病理過(guò)程中［3-6］，控制著靶基因的表達(dá)，而這些靶基因調(diào)控著細(xì)胞的增殖、分化、凋亡。因此ETS 因子是十分重要的轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明在某些腫瘤的發(fā)生過(guò)程中伴隨著多種ETS 因子的表達(dá)失調(diào)［7，8］，因此ETS 因子可能在腫瘤的產(chǎn)生過(guò)程中起到了關(guān)鍵性的作用［9-11］。PDEF 作為ETS 家族轉(zhuǎn)錄因子的一員，其在腫瘤中的作用近年來(lái)受到了重視，尤其是發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸組織中其表達(dá)可以促進(jìn)分泌性祖細(xì)胞向杯狀細(xì)胞分化，因此推斷結(jié)直腸癌的發(fā)生可能與PDEF 的表達(dá)有關(guān)［12］。本文在前期研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建干擾質(zhì)粒，干擾在HT29 細(xì)胞中高表達(dá)的PDEF 基因，觀察對(duì)HT29 細(xì)胞株的生物學(xué)行為的影響，為進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制及靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 E.coli DH5α 克隆菌株及結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞株(PDEF 高表達(dá)，為非侵襲性結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株)為我室留存，DMEM 高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco 公司。PDEF 真核shRNA 干擾質(zhì)粒GV102(sense5'-GGCCGCUUCAUUAGGUGGCUTT-3'，antisense5'-AGCCACCUAAUGAAGCGGCCTT-3')，購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因有限公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega 公司，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑及TRIzol 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公司。四甲基偶氮唑藍(lán)［3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)2、5-diphenyltetra-zolium，MTT］、Boyden chamber含8 μm 濾膜購(gòu)自索萊寶公司，matrigel 購(gòu)自美國(guó)BD公司。鼠抗人PDEF 單克隆抗體購(gòu)自Abcam 公司，鼠抗人β-actin 多克隆抗體及HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 購(gòu)自Santa Cruz 公司。ECL 低背景化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29 常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/ml 的青霉素、100 mg/L 鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 shRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HT29 細(xì)胞株 實(shí)驗(yàn)分組分別為正常對(duì)照組(細(xì)胞未經(jīng)任何處理)、空白對(duì)照組(僅轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒)和shRNA 組(轉(zhuǎn)染特異干擾shRNA)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%融合時(shí)，將5 μl Lipofectamine 2000 與10 μl GV102 或空白對(duì)照質(zhì)粒(空質(zhì)粒)分別稀釋于終體積為500 μl 無(wú)血清無(wú)抗生素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，室溫避光放置20 min，用無(wú)血清無(wú)抗生素DMEM 高糖培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞3 次后，緩慢加入已稀釋好的脂質(zhì)體與質(zhì)粒DNA 混合液，補(bǔ)充無(wú)血清培養(yǎng)基至2 ml，使混合液均勻分布于培養(yǎng)基中。培養(yǎng)6 h 后補(bǔ)加胎牛血清至終濃度為20%，18 h 后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h 后觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)干擾前后PDEF 基因mRNA 的表達(dá) 細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期取出6 孔板中的轉(zhuǎn)染HT29 細(xì)胞，DEPC 水洗3 次后每孔加入1 ml TRIzol，吹打細(xì)胞，移入1.5 ml EP 管中，按照TRIzol 說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞總RNA 提取。取1 μl 抽提的RNA 用DEPC 水稀釋50 倍后，以DEPC 水做空白對(duì)照，測(cè)定RNA 濃度。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按TaKaRa 試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。引物序列為:PDEF 上游引物:5'-TTACAAGAAGGGCATCATCC-3'，下游引物:5'-GAAGGTCAGAGCAGCAGAGC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為188 bp，GAPDH 上游引物:5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3'，下游引物:5'-TTCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'擴(kuò)增產(chǎn)物為202 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR 循環(huán)條件為:95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)干擾前后PDEF 蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，吸棄培養(yǎng)液，用1 ×PBS 洗滌3次。加入RIPA 裂解液，冰上裂解5 min。用細(xì)胞刮子將細(xì)胞碎片和裂解液移至EP 管中，4℃、12 000 r/min，離心20 min，其上清為提取的蛋白。將上清液小心轉(zhuǎn)移至新EP 管中，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度定量后分別加入5 ×SDS-PAGE 上樣緩沖液，沸水煮5 min。上樣進(jìn)行聚丙烯凝膠電泳，半干電轉(zhuǎn)將蛋白條帶轉(zhuǎn)移到PVDF 膜(0.22 μm)上，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，一抗(小鼠抗人PDEF，稀釋度1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜，HRP 標(biāo)記的兔抗鼠IgG 的二抗(1∶1 000)二抗孵育2 h，用TBST 洗膜后，ECL 化學(xué)發(fā)光試劑顯色，β-actin 作為內(nèi)參，圖像分析系統(tǒng)測(cè)定灰度值。

1.2.5 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況 胰酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基吹打成單細(xì)胞懸液，以每孔104個(gè)細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板上，每孔體積100 μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組6 孔，分別在第1、2、3、4、5天以MTT 法檢測(cè)其吸光度(A)值。每孔中加入20 μl MTT(5 mg/ml)液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入150 μl/孔DMSO，震蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm 波長(zhǎng)比色測(cè)定每孔A 值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.6 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn) 將50 μl，1∶3稀釋的Matrigel 膠均勻平鋪于24 孔Transwell 小室8 μm 的PC 膜上，避免產(chǎn)生氣泡，將板置37℃培養(yǎng)箱30 min聚合成凝膠備用。用無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×105ml-1，上室分別加入200 μl 的細(xì)胞懸液，24 孔板下室加入每孔500 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液，每組各3 孔，隨后將裝有Transwell 小室的培養(yǎng)板置入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸棄上室液體、取出小室，以濕棉簽擦去聚碳酸酯微膜上的膠，進(jìn)行蘇木精和結(jié)晶紫染色，沖洗后封片，于倒置顯微鏡下觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)目。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s 表示，服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，用多組間比較，符合方差齊性的，用方差分析。P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 shRNA 干擾質(zhì)粒在HT29 細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑將干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞。由于shRNA 組GV102 帶有EGFP 標(biāo)記，轉(zhuǎn)染成功后可見綠色熒光蛋白表達(dá)。圖1B 為轉(zhuǎn)染36 h后，熒光顯微鏡下觀察的結(jié)果，可見綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明干擾質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入HT29 細(xì)胞株，圖1A為未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組，無(wú)綠色熒光蛋白表達(dá)。

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)PDEF 基因mRNA 表達(dá)的抑制情況 將上述3 組細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，表達(dá)情況用熒光實(shí)時(shí)定量PCR 技術(shù)檢測(cè)，以GAPDH 作為內(nèi)參，每組重復(fù)3 次。經(jīng)2-△△CT分析與空白對(duì)照組相比，空白對(duì)照組為2-△△CT值 為0.99±0.09，shRNA 組 為0.67±0.07。shRNA 組與正常對(duì)照組相比，PDEF 基因mRNA 表達(dá)水平降低34%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而正常對(duì)照組和空白對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，可以說(shuō)明轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒的細(xì)胞中PDEF 基因mRNA 的表達(dá)受到抑制(圖2)。

圖1 熒光顯微鏡觀察HT29 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果圖(×100)Fig.1 Transfer efficiency into HT29 cells under fluorescent microscope(×100)

圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)PDEF 基因mRNA 相對(duì)表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析圖Fig.2 Statistical analysis diagram real-time fluorescent quantitative PCR detection PDEF gene mRNA relative expression

2.3 Western blot 檢 測(cè)PDEF 蛋白表達(dá)情況 Western blot 顯示正常對(duì)照組、空白對(duì)照組及shRNA 組各組灰度比值分別為:0.86±0.03，0.85±0.03，0.52±0.01(圖3B)。shRNA 組與正常對(duì)照組相比，PDEF 蛋白表達(dá)降低(圖3A)，灰度分析顯示，shRNA 組與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞中PDEF 蛋白水平下調(diào)(圖3A)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)?？瞻讓?duì)照組和正常對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖3A)(P ＞0.05)。

圖3 Western blot 分析PDEF 蛋白的表達(dá)Fig.3 Western blot analysis PDEF protein expression

圖4 shRNA-PDEF 對(duì)HT29 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effects of shRNA-PDEF on HT29 cell proliferation

2.4 干擾質(zhì)粒對(duì)HT29 細(xì)胞增殖的影響 分別于細(xì)胞生長(zhǎng)的第1、2、3、4、5 天，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)生成藍(lán)色的formazan 結(jié)晶，加入DMSO 溶解formazan 結(jié)晶，酶標(biāo)儀測(cè)定490nm處的光密度OD值，formazan結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比。OD 值越高反應(yīng)細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)中shRNA 組OD值在細(xì)胞生長(zhǎng)的第3 天開始與空白對(duì)照組相比，OD值明顯增高，表明細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，而正常對(duì)照組與空白對(duì)照組OD 值無(wú)明顯差別(P ＞0.05)，結(jié)果表明PDEF 基因沉默能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖(圖4)。

2.5 Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果 HT29 細(xì)胞轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后48 h，Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、空白對(duì)照組、shRNA 組，各組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為:28.66±2.08、31±6.24、77.33±7.76(圖5)。穿過(guò)Matrigel 膠的干擾組細(xì)胞數(shù)目(圖6)顯著高于正常對(duì)照組的細(xì)胞(圖6)，shRNA 組平均每高倍視野侵出Matrigel 膠的細(xì)胞數(shù)與正常對(duì)照組相比顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，空白對(duì)照組平均每高倍視野侵出Matrigel 膠的細(xì)胞數(shù)(圖6)與正常對(duì)照組(圖6)相比無(wú)顯著差異(P ＞0.05)，結(jié)果表明干擾PDEF 基因表達(dá)后，HT29 細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。

圖5 各組HT29 穿膜細(xì)胞數(shù)Fig.5 Numbers of invasion HT29 cells in each group

圖6 HT29 細(xì)胞Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)光鏡照片(×200)Fig.6 HT29 cell Transwell experiment using photos (×200)

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的消化道腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)［13］。對(duì)于該疾病的治療已經(jīng)有了很大的進(jìn)展，但治療方法特異性低，導(dǎo)致了治療效果欠佳。因此研究對(duì)于該疾病的較特異的治療方案是提高大腸癌患者生存率的關(guān)鍵。因而，尋找結(jié)直腸癌特異的治療方法具有重要的意義。

PDEF 是個(gè)新發(fā)現(xiàn)的EST 家族的轉(zhuǎn)錄因子，相對(duì)分子質(zhì)量為37 500 Da［14］，定位于6 號(hào)染色體短臂上(6P21.3)，PDEF 中存在許多磷酸化位點(diǎn)，可能參與多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，已有研究報(bào)道，在一些腫瘤的形成過(guò)程中［15-17］，伴隨著PDEF 的表達(dá)失調(diào)，這表明PDEF 因子具有較強(qiáng)的腫瘤相關(guān)性特點(diǎn)［18-21］。本研究在該課題前期研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步干擾PDEF 基因的表達(dá)可能為結(jié)腸癌的治療提供新的思路。

本文通過(guò)shRNA 技術(shù)沉默人結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29 中PDEF 基因的表達(dá)，觀察該基因沉默后HT29 細(xì)胞生物學(xué)行為如細(xì)胞增殖和侵襲的改變。RT-PCR、Western blot 結(jié)果表明干擾PDEF 基因后HT29 細(xì)胞中PDEF 基因mRNA 及蛋白的表達(dá)水平與正常對(duì)照組和空白對(duì)照組相比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線分析表明，shRNA 組與正常對(duì)照組、空白對(duì)照組相比細(xì)胞增殖能力加強(qiáng)(P ＜0.05)。

本實(shí)驗(yàn)在體外證明了PDEF 在結(jié)直腸癌細(xì)胞中發(fā)揮了潛在的抑癌作用，抑制其表達(dá)促進(jìn)了HT29細(xì)胞的增殖與侵襲能力。雖然本研究體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持PDEF 在結(jié)直腸癌中的抑癌作用，但其具體的發(fā)病機(jī)制還有待研究，進(jìn)一步的組織學(xué)水平和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有待開展。PDEF 作為轉(zhuǎn)錄因子，很可能是影響了某種靶基因的表達(dá)，而該靶基因必定在細(xì)胞的增殖分化等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，因此尋找PDEF 作用的靶基因也是下一步研究工作的重點(diǎn)，這有望為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)，將有可能為結(jié)直腸癌的靶向治療提供新的途徑。

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