杜 博 魏海峰 趙雪梅 倪志強(qiáng) 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心，長春 130021)

食管癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，其發(fā)生是一個多因素、多階段的，涉及多種基因異常表達(dá)的復(fù)雜生物學(xué)過程。分子生物學(xué)研究揭示:細(xì)胞增殖活性異常、癌基因和/或抑癌基因的突變、過度表達(dá)以及細(xì)胞凋亡過程的抑制，在食管癌發(fā)病機(jī)制中均起重要作用［1］。此外，腫瘤細(xì)胞的快速生長有賴于高程度的能量代謝和大量的蛋白合成，而蛋白合成則需要充足的氨基酸供給。大型氨基酸轉(zhuǎn)運載體1(Large-type amino acid transporter 1，LAT1)是一種不依賴Na+的大型、中性氨基酸轉(zhuǎn)運載體［2］。近年來有關(guān)資料顯示LAT1 高表達(dá)與人類多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［3，4］，但在食管癌中的表達(dá)國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。本研究采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測食管癌及癌前病變組織中增殖細(xì)胞核抗原(Ki-67)、腫瘤抑制基因P53(P53)及LAT1 基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，分析它們與食管癌病理分級的相關(guān)性，以探討食管癌的發(fā)生機(jī)制，為食管癌的早期診斷和預(yù)后評估提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床病理標(biāo)本 選取吉林省人民醫(yī)院2011 年至2014 年食管鱗癌手術(shù)切除標(biāo)本及胃鏡活檢組織，所有病例均未接受術(shù)前放化療，且均經(jīng)病理學(xué)確診。標(biāo)本分為正常組20 例，癌前病變組68 例(其中輕度非典型增生21 例，中度非典型增生22 例，重度非典型增生25 例)及食管癌組34 例。

1.2 實驗試劑 即用型鼠抗人Ki-67 單克隆抗體，即用型鼠抗人P53 單克隆抗體及SP 試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，即用型兔抗人LAT1抗體購自美國Santa Cruz 公司。

1.3 免疫組化染色方法 所有標(biāo)本均采用4%的中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片、HE 染色。所有石蠟標(biāo)本均經(jīng)4 μm 連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟后用SP 法染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，DAB 顯色后，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封固。以PBS 代替一抗作為陰性對照，以試劑公司提供的陽性切片作為陽性對照。

1.4 染色結(jié)果判定 在排除非特異性染色的前提下，Ki-67、P53 蛋白陽性染色定位于細(xì)胞核，出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性信號。LAT1 以胞膜和胞漿中見到棕黃色顆粒分布為陽性。每張切片隨機(jī)選擇5 個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100 個腫瘤細(xì)胞，取其平均值為細(xì)胞的陽性率。按陽性細(xì)胞所占的比例及顯色深度區(qū)分:陽性細(xì)胞數(shù)所占比例＜10%為陰性(-);10%～25%為弱陽性(+)，顯色淺，顆粒細(xì);26%～50%為中度陽性(++)，顯色較深;＞50%為強(qiáng)陽性(+++)，顯色深，顆粒粗。由兩名有經(jīng)驗的病理科醫(yī)生分別進(jìn)行盲法判讀。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用Pearson χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman 等級相關(guān)分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌及癌前病變組織中的表達(dá) Ki-67、P53、LAT1 在正常食管黏膜組織中均無陽性表達(dá)，但在輕度非典型增生、中度非典型增生、重度非典型增生以及癌組織中均有陽性表達(dá)。Ki-67、P53、LAT1 在食管癌組織中的陽性表達(dá)顯著高于癌前病變各組中的表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P ＜0.01，且Ki-67、P53、LAT1 的異常表達(dá)與組織學(xué)分級均顯著相關(guān)，見表1。

表1 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌及癌前病變組織中的表達(dá)［n(%)］Tab.1 Expression of Ki-67，P53 and LAT1 in tissues of esophageal carcinoma and precancerous lesions［n(%)］

表2 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌中表達(dá)的相關(guān)性Tab.2 Correlation between expression of Ki-67，P53 and LAT1 in esophageal carcinoma

2.2 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Ki-67、P53、LAT1 在食管癌組織中的表達(dá)經(jīng)等級相關(guān)分析結(jié)果顯示，三者在食管癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.428，0，596，P ＜0.01)，見表2。

3 討論

食管癌的發(fā)生發(fā)展是多種蛋白因子相互作用的結(jié)果，涉及有絲分裂機(jī)制的激活、凋亡機(jī)制的失活等多個方面。增殖細(xì)胞核抗原Ki-67 是目前應(yīng)用最為廣泛的標(biāo)記細(xì)胞增殖活性的指標(biāo)，主要針對處于增殖周期的人類細(xì)胞核原抗體，其標(biāo)記的增殖指數(shù)能夠可靠地反映細(xì)胞的增殖活性，有利于預(yù)測癌變的可能性。P53 是一種重要的抑癌基因，其抗腫瘤作用主要是阻滯G1/G0 期使細(xì)胞不能進(jìn)入S 期，從而抑制細(xì)胞的增殖，在誘發(fā)細(xì)胞凋亡中起到了重要作用。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現(xiàn)該基因的突變。突變型P53 蛋白半衰期延長，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)突變型P53 蛋白的集聚，因而用免疫組化方法能夠檢出。有研究報道腫瘤細(xì)胞分化越差、浸潤范圍越廣，淋巴結(jié)陽性，P53 表達(dá)水平就越高［5］。LAT1 為可溶性載體家族成員，可通過影響mTOR 通路參與細(xì)胞的生長及分化，LAT1 高表達(dá)與人類多種類型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等［6-8］，并已證實在小細(xì)胞肺癌中LAT1 作為miR-126 的靶基因，與肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［9］。

本研究結(jié)果顯示，Ki-67、P53 及LAT1 在正常食管黏膜組織中未見陽性表達(dá)，而在輕度非典型增生、中度非典型增生、重度非典型增生以及食管癌組織中，三者的陽性表達(dá)率均逐漸增高，且表達(dá)水平與組織學(xué)分級呈正相關(guān)，提示細(xì)胞增殖活性上升、P53 基因及LAT1 基因表達(dá)上調(diào)與食管癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，Ki-67 與P53、LAT1 在食管癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.428，0.596，P＜0.01)，這提示Ki-67 表達(dá)水平的升高可顯著增加食管癌的增殖能力，而這一過程可能伴有突變型P53 基因和/或LAT1 基因的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞增殖與分化或抑制凋亡，從而加速了食管癌的發(fā)展進(jìn)程。這三個指標(biāo)具有作為食管癌治療特異性靶點的潛力，同時三者聯(lián)合檢測有可能作為食管癌不良生物學(xué)行為的分子標(biāo)志物，在食管癌早期診斷、篩選食管癌癌前高危個體等方面具有重要的臨床意義。

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