張雯靜，陳潔，孔靜萍

兩種型號的自動免疫組化染色機的應(yīng)用及體會

張雯靜，陳潔，孔靜萍

目的探討兩種型號的自動免疫組化染色機在病理工作中的應(yīng)用。方法收集已診斷明確的乳腺癌標本30例和卵巢癌標本10例，選擇5種常用的免疫標記，分別用ROCHE公司的BenchMark XT和DAKO公司的Autostainer Link 48自動免疫組化染色機分別進行染色。結(jié)果兩種型號的自動免疫組化染色機均取得較為滿意的染色結(jié)果，信號強，結(jié)構(gòu)清晰，定位準確，非特異性染色著色少。結(jié)論自動免疫組化染色機標準化程度高，能為臨床病理診斷提供更準確的依據(jù)。

試劑；抗原修復(fù)；一抗；自動免疫組化染色機

臨床對病理工作的要求越來越高，病理診斷和方法的標準化尤其顯得重要，其中技術(shù)規(guī)范化是標準化的一個重要方面。自動免疫組化染色機對免疫組化標準化程度的提高起到了一定的推動作用[1]。寧波市病理中心從2011年底引進8臺ROCHE公司的BenchMarkXT和DAKO公司的AutostainerLink48自動免疫組化染色機，染色結(jié)果較為滿意。本文就這兩種型號的自動免疫組化染色機的操作及不同點作一探討?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料收集病理中心2012年6月至2013年1月期間已診斷明確的乳腺癌標本30例和卵巢癌標本10例，選擇雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、人類表皮生長因子受體2（Her-2）、細胞角蛋白廣譜（CK-pan）和卵巢癌抗原（CA125）這幾種較為常用的免疫標記，ROCHE公司的BenchMark XT自動免疫組化染色機，DAKO公司的AutostainerLink48自動免疫組化染色機，PTLINK脫蠟修復(fù)一體機，二抗及DAB顯色系統(tǒng)、復(fù)染液均為機器自帶的成品配套試劑。

1.2 方法標本用10%甲醛進行固定，經(jīng)自動脫水機進行脫水、透明、浸蠟，石蠟包埋后行組織切片，切片厚度3m，無皺褶和刀痕，同一組織連續(xù)切兩張切片，各兩組，石蠟切片在（60±5）℃恒溫箱烤片，時間在40min左右，最長不超過2h，以免破壞組織中的抗原，分別用兩張型

號的免疫組化染色機進行染色操作。

1.2.1 BenchMark XT染色機根據(jù)一抗及蠟塊信息，打印條形碼標簽，端正貼于切片上，打開儀器將切片按標簽朝金屬盤中心放置在切片盤上，確保每張切片放穩(wěn)，固定于4個卡齒之內(nèi)；將二抗DAB試劑盒、復(fù)染液、一抗等試劑瓶放在檢測試劑架上，檢查加樣口是否充滿液體，確認儀器裝載的AFM試劑桶中有足夠多的滿足本次運行的試劑量，打開計算機桌面上的Ventana NexES軟件，確認信息后，啟動電腦程序。染色完成后，取出切片并用洗潔精洗去玻片上的油污，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 Autostainer Link 48染色機輸入信息并打印二維碼標簽貼于切片上，將切片插入切片架的切片夾上浸泡于PT LINK脫蠟修復(fù)一體機進行脫蠟水化抗原修復(fù)，完成后移出切片架立即浸入含有0.05%Tween20的緩沖液中至少5 min，將本次運行所需的試劑瓶按瓶口在左，二維碼在右放于試劑架上，確認有滿足此次運行的試劑量，將切片架置于染色儀中，打開軟件進入儀器界面，點擊“START”開始染色程序，運行結(jié)束后，同樣進行脫水、透明、封片步驟。

2 結(jié)果

兩種型號的自動免疫組化染色機染色均勻，結(jié)構(gòu)清晰，定位準確，無邊緣效應(yīng)，非特異性著色少。ER、PR、Her-2、CK-pan免疫標記染色強度差異不明顯（封三彩圖9～10），但CA125標記，Bench-MarkXT染色強度高于AutostainerLink 48（封四彩圖1）。

3 討論

自動免疫組化染色機染色結(jié)果穩(wěn)定，可重復(fù)性高，為免疫組化標準化提供了有力的條件[2]。兩種型號儀器的實驗條件及操作方式也有所不同，現(xiàn)分析如下。

3.1 染色程序運行前BenchMark XT注冊新試劑是用注冊棒接觸注冊卡上的數(shù)據(jù)按鈕，關(guān)聯(lián)抗體信息及成品配套試劑盒中的試劑信息，使用的標簽采用條形碼技術(shù)，條形碼標簽需端正貼于玻片上，不能有皺折，標簽表面無水分，才能保證儀器正常掃描[3]。用戶填充試劑瓶加注一抗時，為保證抗體效價應(yīng)每次少量灌注，只需能滿足此次運行所需的抗體量，試劑瓶管口呈半月形液面，不需要一定的底液（廢液）量；每個染色方案默認的試劑加液量均為100l，一臺Bench-Mark XT染色機一次可運行的容量為30張切片，開放性試劑架上可以選擇應(yīng)用35種不同的試劑（包括配套試劑盒、一抗等）。Autostainer Link 48定義一個新試劑是用紅外線掃描儀掃描試劑瓶口旁的二維碼信息，軟件自動儲存試劑信息。它所使用的是二維碼標簽，二維碼信息密度高，糾錯能力強，相對尺寸小，比作為一維碼的條形碼更具有優(yōu)勢，在程序運行中掃描更快捷[4]。每個試劑瓶按瓶子本身的規(guī)格，5 ml試劑瓶和12 ml試劑瓶各有0.6 ml和1.2 ml的底液量，這些試劑量也就是廢液量，不能用于本次染色程序，是額外增加的試劑成本。在染色程序運行前，實驗人員可根據(jù)每張切片上的組織塊位置，調(diào)整試劑滴加的位置和試劑量，一般一個加樣區(qū)滴加150 l，如果組織比較大需要二個加樣區(qū)，每個區(qū)域的加樣量各為100l。一臺Autostainer Link 48染色機一次可運行48張切片，一個工作臺可裝載兩個獨立的試劑架，每個試劑架容納21個試劑瓶，一次運行的數(shù)量比BenchMark XT染色機多。

3.2 運行染色程序BenchMarkXT染色機脫蠟、抗原修復(fù)、孵育、顯色、復(fù)染全都在機器內(nèi)自動完成，染色過程中裝有切片的金屬盤處于密閉狀態(tài)，實驗人員通過軟件監(jiān)控切片盤的溫度、壓力，試劑加樣等情況。一臺儀器從掃描到進入染色程序需要5 min，如試劑裝載錯誤或切片放置不平，在校正后染色機重新掃描程序。切片用PH8.4的EDTA修復(fù)，抗原修復(fù)溫度為99.5℃，一抗孵育溫度是37℃，采用Thermopad溫控技術(shù)，每張切片獨立溫控，37℃至95℃4min，95℃至37℃7min，提供最佳反應(yīng)動力學(xué)。利用空氣渦流混勻技術(shù)，保證組織全層覆蓋，試劑充分混勻，避免邊緣效應(yīng)和階梯效應(yīng)。在染色過程中，每次加樣后都會滴加液體封蓋膜，保證試劑不被蒸發(fā)，提供穩(wěn)定的染色結(jié)果。每次加樣前后都有清洗步驟，利用雙清洗和噴氣清洗，保證洗去之前染色的殘留液，減少背景著色。Autostainer Link 48染色機的脫蠟及修復(fù)程序是在PT LINK機上完成，其他步驟則是在染色機上完成。PTLINK儀器將稀釋比1∶50的PH 9.0 EDAT修復(fù)液預(yù)熱至65℃，費時14min，然后放入切片架后進行脫蠟修復(fù)，95℃熱浴10～15min，修復(fù)結(jié)束并冷卻至70℃后，移出切片架至緩沖液中至少浸泡5 min后上機。染色機是半敞開式的，便于實驗人員更直觀的觀察切片的染色情況。從掃描開始到進行染色程序需時2 min，試劑瓶放置不正確或缺如，重新裝載后，掃描會從上次掃描的最后位接下去繼續(xù)讀取試劑信息，節(jié)省了運行時間。染色過程在室溫中進行，每次加樣前，機械臂中的空氣噴嘴泵去除上次試驗的試劑并用PBS緩沖液沖洗切片，之后試劑探針滴加試劑。保濕室關(guān)閉時，創(chuàng)建一個密封的環(huán)境，確保切片在運行中不干燥，防止出現(xiàn)非特異性背景著色。Autostainer Link 48染色機滴加一抗試劑時，只是滴加在實驗人員定義的組織在玻片上的位置，如遇到組織體積大，由于沒有混勻技術(shù)，試劑不能全層覆蓋，會出現(xiàn)染色不均的情況（封四彩圖2）。

3.3 儀器的清洗、維護BenchMark XT染色機每次運行結(jié)束后均應(yīng)執(zhí)行清洗循環(huán)，每周用熱肥皂水、熱水、去離子水依次清潔切片盤，定期清洗廢液桶，向空桶中加入一定量的的濃縮消毒滅菌液，保持數(shù)分鐘后排空。用“花王”牌漂白水進行季度保養(yǎng)維護，每染色制片12 500張或每6個月需由專業(yè)工程師進行全面維護，以保證儀器發(fā)揮其最佳性能[4]。Autostainer Link 48染色機軟件從最后一個清洗循環(huán)監(jiān)控染色切片的數(shù)量，每完成200張切片，機器自動提示需進行一次清洗循環(huán)。為保證染色正常運行，所有的試劑瓶必須保持清潔，應(yīng)使用無水乙醇沖洗3遍以清除潛在的污染物，每次使用后，用去離子水沖洗切片架，刷去積存的殘留鹽，每年的維修由專業(yè)的DAKO技師完成，基礎(chǔ)的預(yù)防性維護必須聯(lián)系當?shù)氐腄AKO代表進行操作。

總之，使用自動免疫組化染色機縮

短了操作時間，使預(yù)實驗標準化，提供了靈活的程序，保證染色結(jié)果的穩(wěn)定，可以有效地保證染色的準確性，可重復(fù)性及整體染色的一致性[5]，自動免疫組化染色機標準化程度高，能為臨床病理診斷提供更準確的依據(jù)。

[1]陳芳,李海.全自動免疫組織化學(xué)染色技術(shù)的應(yīng)用[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志,2011, 10（20）:1613-1614.

[2]楊月紅,袁靜萍,袁修學(xué),等.自動免疫組化儀的使用體會[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2011,27(3):333-334.

[3]林蓁,田甜.提高全自動免疫組化儀制片質(zhì)量的相關(guān)細節(jié)[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志，2012,28（6）:700-701.

[4]楊軍,劉艷,杜彥蕊.關(guān)于二維碼的研究和應(yīng)用[J].應(yīng)用科技雜志,2002,29（11）:11-13.

[5]羅玉鳳,曹金伶,楊春明,等.免疫組化手工操作與機器制片染色比較[J].協(xié)和醫(yī)學(xué)雜志,2012,3(1):117-119.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.12.065

R446

A

1671-0800(2014)12-1572-03

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