楊景哲 王 芳 耿琪瑛 陳鳳平 馮欣姝 溫海玲
承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科,河北承德067000
rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用對(duì)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面病原菌的影響
楊景哲▲王 芳▲耿琪瑛 陳鳳平 馮欣姝 溫海玲
承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科,河北承德067000
目的研究重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和納米銀聯(lián)合外用,對(duì)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合過程病原菌分布及其耐藥性分析。方法用Wistar大鼠建立深Ⅱ度燙傷模型,分為A、B、C、D四組,A組(30例):凡士林紗布覆蓋,B組(30例):納米銀覆蓋,C組(30例):rhGM-CSF涂抹創(chuàng)面,D組(30例):rhGM-CSF+納米銀覆蓋,傷后第1、4、7、10、14、21天,創(chuàng)面分泌物細(xì)菌培養(yǎng)并計(jì)數(shù),細(xì)菌分離鑒定,測(cè)定細(xì)菌耐藥譜。結(jié)果A組在第4、7、10、14、21天均培養(yǎng)出細(xì)菌[(3.22±1.04)×104/cm2、(4.57±1.15)×104/cm2、(8.13±1.25)×104/cm2、(16.36±3.22)× 104/cm2、(14.52±3.10)×104/cm2];B、C兩組在第10、14、21天培養(yǎng)出細(xì)菌[B組:(5.67±0.77)×104/cm2、(8.14±1.21)× 104/cm2、(6.86±0.96)×104/cm2;C組:(4.38±1.44)×104/cm2、(6.80±0.85)×104/cm2、(4.94±0.40)×104/cm2];D組在第14、21天培養(yǎng)出細(xì)菌[(4.10±0.47)×104/cm2、(2.46±0.76)×104/cm2]。第10、14、21天,A、B、C、D組細(xì)菌計(jì)數(shù)比較,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。革蘭陽(yáng)性菌以金黃色葡萄球菌居首位;革蘭陰性菌以銅綠假單胞菌居首位。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,金黃色葡萄球菌主要對(duì)青霉素G、環(huán)丙沙星、利福平、苯唑西林、氧氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素等耐藥,銅綠假單胞菌主要對(duì)哌拉西林、奈替米星、頭孢吡肟、哌拉西林他唑巴坦、慶大霉素等耐藥,病原菌對(duì)抗菌藥物敏感性均為D組>C組>B組>A組。結(jié)論rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用,減少深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面細(xì)菌生長(zhǎng),提高病原菌對(duì)抗菌藥物的敏感性。
重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子;納米銀;燒傷創(chuàng)面;病原菌;耐藥性
燒(燙)傷是常見的機(jī)體損傷,隨著診療技術(shù)的進(jìn)步,以前困擾燒傷治療的休克期復(fù)蘇,因量化公式、容量監(jiān)測(cè)儀器的應(yīng)用,而逐漸成熟,而燒傷創(chuàng)面外用敷料種類繁多,但是如何合理有效利用,至今在燒傷治療方面仍是一個(gè)盲區(qū)。rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)、啟動(dòng)免疫應(yīng)答,可控制燒傷創(chuàng)面炎性反應(yīng)。而深Ⅱ度創(chuàng)面在愈合過程中溶痂極易感染,致創(chuàng)面加深,同時(shí)長(zhǎng)期抗生素應(yīng)用,致耐藥菌群比例增高,殘余創(chuàng)面經(jīng)久不愈。因此合理的創(chuàng)面外用藥物,直接影響深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面的愈合周期及整體治療的病程和轉(zhuǎn)歸。而rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用治療深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面,一方面可以控制感染,減輕創(chuàng)面炎癥反應(yīng),加速創(chuàng)面愈合;另一方面可以減少抗生素的使用量,縮短治療周期,降低治療費(fèi)用,對(duì)燒傷整體治療有積極意義,對(duì)搶救生命至關(guān)重要。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組
Wistar大鼠120只,200~220 g,雌雄各半,由天津山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司購(gòu)買。水合氯醛1 mL/kg腹腔注射麻醉,背部去毛后用99℃紗布覆蓋10 s,造成4 cm×4 cm大小深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面(病理切片證實(shí)),傷后創(chuàng)面分別用A、B、C、D四種方法處理,每組30只,A組:凡士林紗布覆蓋,B組:生理鹽水濕潤(rùn)納米銀醫(yī)用抗菌敷料(購(gòu)買自深圳市愛杰特醫(yī)藥科技有限公司)覆蓋,C組:rhGM-CSF(購(gòu)買自長(zhǎng)春金賽藥業(yè)有限公司)涂抹創(chuàng)面,D組:rhGM-CSF+納米銀敷料覆蓋,創(chuàng)面無菌敷料包扎,每天換藥,分別于傷后第1、4、7、10、14、21天留取創(chuàng)面分泌物標(biāo)本,至第21天,終止實(shí)驗(yàn)。
1.2 主要儀器及試劑
電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9272,上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),細(xì)菌培養(yǎng)儀(Bact/ALERT 3D培養(yǎng)儀,法國(guó)梅里埃公司),細(xì)菌鑒定儀(VITEK2TM-compact,法國(guó)梅里埃公司),藥敏試驗(yàn)所用藥敏紙片(英國(guó)OXOID公司),藥物敏感標(biāo)準(zhǔn)菌株(金黃色葡萄球菌ATCC25923,銅綠假單胞菌ATCC27853,大腸埃希菌ATCC25922,肺炎克雷伯桿菌ATCC700603,原衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心細(xì)菌室)。
1.3 創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)、計(jì)數(shù)
創(chuàng)面分泌物用咽拭子涂抹整個(gè)創(chuàng)面,注射用水10 mL浸泡,分別取其中的10 μL在9 cm血平板(中國(guó)藍(lán)瓊脂+血瓊脂)及麥康凱平皿上均勻劃線,在37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h,菌落計(jì)數(shù),運(yùn)用細(xì)菌鑒定儀根據(jù)革蘭染色鏡檢及生化鑒定。
1.4 藥敏試驗(yàn)
根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSI,2011年版)標(biāo)準(zhǔn),采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行試驗(yàn)及結(jié)果判定。選擇抗生素紙片為青霉素G、苯唑西林、哌拉西林、阿莫西林、克林霉素、頭孢呋辛鈉、紅霉素、萬古霉素、利奈唑胺、替考拉寧、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、慶大霉素、四環(huán)素、氨芐西林、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢哌酮舒巴坦、頭孢西丁、頭孢吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林他唑巴坦、利福平、阿米卡星、奈替米星、米諾環(huán)素、氯霉素。
按照CLSI要求,耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測(cè)采用30 μg頭孢西丁進(jìn)行檢測(cè),針對(duì)凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌,測(cè)其抑菌環(huán)直徑≤21 mm判斷為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA),>21 mm判斷為耐甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
運(yùn)用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組間不同時(shí)相點(diǎn)差異采用F檢驗(yàn),兩兩比較行SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)及計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)
在傷后第1天創(chuàng)面細(xì)菌培養(yǎng)中,各組創(chuàng)面均無細(xì)菌生長(zhǎng),A組在第4天培養(yǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng),B組、C組在第10天培養(yǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng),D組在第14天培養(yǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng)。組間比較,第10、14、21天,F(xiàn)值分別為36.28、43.59、48.14,各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。組內(nèi)比較,第10、14、21天,B組與C組細(xì)菌計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值分別為1.82、1.63、2.15,均P>0.05);第10、14、21天,A組與B組、C組、D組,B組與D組,C組與D組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表1。
表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌數(shù)量比較(×104/cm2,x±s)
2.2 病原菌分布情況
A組在第4天出現(xiàn)細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性,B、C組均在第10天細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性,D組在第14天細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性,在培養(yǎng)菌群中,革蘭陽(yáng)性菌以金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌為主;革蘭陰性菌以銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、大腸埃希菌為主,不動(dòng)桿菌的毒性較弱,臨床癥狀不明顯;真菌以白色念珠菌為主。A、B、C、D組在第14、21天均培養(yǎng)有細(xì)菌生長(zhǎng),分別對(duì)第14、21天病原菌分布情況進(jìn)行分析,各組中,革蘭陽(yáng)性菌均為金黃色葡萄球菌檢出率最高,革蘭陰性菌均為銅綠假單胞菌檢出率最高。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),各組創(chuàng)面的不斷縮小,細(xì)菌總數(shù)不斷減少,但是A組極易耐藥的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌檢出率在增高,B組基本持平,而C、D組在下降。病原菌分布情況見表2。
表2 各組不同時(shí)間創(chuàng)面病原菌分布情況[n(%)]
2.3 主要病原菌藥物耐藥率統(tǒng)計(jì)
藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,革蘭陽(yáng)性菌主要對(duì)青霉素G、環(huán)丙沙星、利福平、苯唑西林、氧氟沙星、慶大霉素、四環(huán)素等耐藥,革蘭陰性菌主要對(duì)哌拉西林、奈替米星、頭孢吡肟、哌拉西林他唑巴坦、慶大霉素等耐藥。
2.3.1 金黃色葡萄球菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率統(tǒng)計(jì)在第14、21天,A組金黃色葡萄球菌檢出率最高,分別為36.7%及43.3%,D組最低,分別為23.3%及20.0%,對(duì)利奈唑胺、替考拉寧敏感,并且對(duì)于其他藥物敏感性均為D組>C組>B組>A組。金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率見表3。
表3 各組第14、21天創(chuàng)面金黃色葡萄球菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]
2.3.2銅綠假單胞菌對(duì)常見抗菌藥物的耐藥率在第14、21天,A組銅綠假單胞菌檢出率最高,分別為16.7%及20.0%,D組最低,均為13.3%,對(duì)頭孢哌酮舒巴坦和美羅培南敏感性較高,對(duì)哌拉西林、奈替米星、頭孢吡肟完全耐藥,并且對(duì)于其他藥物敏感性均為D組>C組>B組>A組。銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥率見表4。
燒傷發(fā)生后細(xì)菌的移位、感染是燒傷治療面臨的首要問題,而深Ⅱ度燒傷感染易導(dǎo)致創(chuàng)面加深、殘余創(chuàng)面不愈。創(chuàng)面感染是最常見的燒傷感染來源,燒傷患者皮膚、黏膜受損,屏障作用遭到破壞,正常皮膚表面有大量細(xì)菌,燒傷后很難避免細(xì)菌感染,而且壞死組織的液化和炎性物質(zhì)的滲出,致使損傷表面營(yíng)養(yǎng)豐富,為感染菌生長(zhǎng)提供了有利條件。同時(shí)在燒傷治療過程中各種有創(chuàng)操作的進(jìn)行,如動(dòng)靜脈置管、留置導(dǎo)尿、氣管切開、呼吸機(jī)的使用,使燒傷患者對(duì)病原菌易感性增加[1],濫用抗菌藥物除導(dǎo)致敏感性細(xì)菌產(chǎn)生耐藥外,還破壞了人體內(nèi)的微生態(tài)平衡,造成“條件致病菌”成為燒傷創(chuàng)面感染的病原菌[2]。各個(gè)地區(qū)的燒傷感染病原菌的種類分布和耐藥狀況不盡相同,并有不同的變異趨勢(shì)。所以,燒傷創(chuàng)面感染的預(yù)防與控制對(duì)于患者的治療、預(yù)后有十分重要的意義。
表4 各組第14、21天創(chuàng)面銅綠假單胞菌對(duì)抗菌藥物的耐藥情況[n(%)]
rhGM-CSF作為基因工程產(chǎn)物,通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng),啟動(dòng)炎癥細(xì)胞因子,增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[3],改善創(chuàng)面局部炎性趨化反應(yīng)。rhGM-CSF局部外用可吸引炎癥細(xì)胞及修復(fù)細(xì)胞至創(chuàng)面,活化中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞,增強(qiáng)其吞噬和分泌功能,提高創(chuàng)面自身的抗感染能力,從而在適度炎性反應(yīng)下介導(dǎo)創(chuàng)面愈合[4-5]。納米銀敷料是采用納米技術(shù),將單質(zhì)銀制成粒徑約為25 nm的銀微粒,銀與菌體蛋白中的巰基(-SH)結(jié)合,引起其變性,使巰基酶失活發(fā)揮其廣譜抗菌作用。rhGM-CSF和納米銀敷料相結(jié)合,細(xì)菌耐藥性分析提示,并沒有出現(xiàn)廣泛耐藥菌群的出現(xiàn),對(duì)于較少創(chuàng)面細(xì)菌生長(zhǎng)、控制創(chuàng)面炎性反應(yīng)方面有優(yōu)勢(shì)。
深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面臨床治療過程中,燒傷感染以細(xì)菌為主,長(zhǎng)期廣譜抗生素的應(yīng)用,后期可能出現(xiàn)真菌感染。本組資料顯示,金黃色葡萄球菌在革蘭陽(yáng)性菌居首位,銅綠假單胞菌在革蘭陰性菌居首位,且二者極易出現(xiàn)耐藥性,與大部分燒傷病房病原學(xué)研究相一致[6-7],也有不同的研究結(jié)果,而高玲等[8]研究提示,革蘭陰性菌中不動(dòng)桿菌比例最高,吳肖峰[9]燒傷創(chuàng)面研究發(fā)現(xiàn),革蘭陰性菌銅綠假單胞菌居首位,緊隨其后的是革蘭陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌,說明燒傷創(chuàng)面細(xì)菌感染菌株組成具有一定的地區(qū)差異。Fadeyibi等[10]在尼日利西南部的研究提示銅綠假單胞菌比例最高,并且明顯高于金黃色葡萄球菌,而本課題實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,革蘭陽(yáng)性菌中,金黃色葡萄球菌比例明顯高于銅綠假單胞菌。創(chuàng)面治療過程中第14、21天,也是溶痂后創(chuàng)面愈合階段,A、B組革蘭陽(yáng)性菌比例較高,而C、D組革蘭陰性菌比例較高,革蘭陽(yáng)性菌的大量生長(zhǎng),不利于創(chuàng)面炎性反應(yīng)及全身性感染的控制。rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用,協(xié)同的抑菌作用,在很大程度上減少細(xì)菌生長(zhǎng),控制燒傷后創(chuàng)面炎性反應(yīng)方面相得益彰。
rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用不會(huì)增加耐藥菌的產(chǎn)生,而目前燒傷創(chuàng)面治療過程中,大量廣譜抗生素的應(yīng)用,易致金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯桿菌等多重耐藥的產(chǎn)生,并且金黃色葡萄球菌成為燒傷感染的優(yōu)勢(shì)菌群,耐藥細(xì)菌的種類和數(shù)量在增加[11],尤其是臨床抗菌藥物的不合理應(yīng)用和開放性有創(chuàng)操作,使抗生素的耐藥率逐漸上升,同時(shí)MRSA的檢出率也逐年上升[12],在金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌耐藥菌群分析中可以看出,在燒傷治療第14天,即創(chuàng)面開始溶痂愈合時(shí),正常治療的敏感抗生素已經(jīng)出現(xiàn)大量耐藥的情況,利奈唑胺和替考拉寧仍保持對(duì)金黃色葡萄球菌的敏感性,美羅培南和頭孢哌酮舒巴坦對(duì)銅綠假單胞菌有較高敏感性,第21天,耐藥抗生素比例降低,尤其是D組,與創(chuàng)面大部愈合、溶痂期結(jié)束、感染控制有關(guān),rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用有效的抑制了深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面細(xì)菌的生長(zhǎng)和耐藥菌產(chǎn)生,所以在適量抗生素應(yīng)用的前提下,rhGM-CSF和納米銀聯(lián)合外用作為合理的創(chuàng)面外用敷料,可以減輕燒傷后創(chuàng)面感染,減少燒傷后耐藥菌群的產(chǎn)生,縮短抗生素的使用時(shí)間,對(duì)臨床工作有很大的指導(dǎo)和幫助。
燒傷創(chuàng)面外用敷料的研究逐漸趨向復(fù)合生物材料,并且在臨床上效果已經(jīng)得到了廣泛認(rèn)可和支持,但是更全面、多中心臨床試驗(yàn)工作的展開,是指導(dǎo)臨床工作的前提,有待全面開展。
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Effect of recombinant human Granulocyte/macrophage colonystimulating factor combined with nano-silver for deep burn degreenⅡabout pathogens
YANG Jingzhe▲WANG Fang▲GENG QiyingCHEN FengpingFENG XinshuWEN Hailing
Department of Burns and Plastic Surgery,the Affiliated Hospital of Chengde Medical University,Hebei Province, Chengde067000,China
ObjectiveTo study the distribution and drug resistance of the pathogens,about recombinant human Granulocyte/macrophage colonystimulating factor(rhGM-CSF)combined with nano-silver as a treatment for deep burn degreenⅡ.MethodsThe burn model were done with Wistar rats.They were randomly divided into four groups,petrolatum treatment(group A,n=30),nano-silver treatment(group B,n=30),rhGM-CSF treatment(group C,n=30),and rhGM-CSF combined with nano-silver treatment(group D,n=30).Bacteria were cultured,isolated identified,and determined antibiotics spectrum,on postburn day 1,4,7,10,14,21 in all groups.ResultsThere were bacterias in group A on postburn day 4,7,10,14,21[(3.22±1.04)×104/cm2,(4.57±1.15)×104/cm2,(8.13±1.25)×104/cm2,(16.36±3.22)×104/cm2, (14.52±3.10)×104/cm2].There were bacterias in group B and group C on postburn day 10,14,21[group B:(5.67±0.77)× 104/cm2,(8.14±1.21)×104/cm2,(6.86±0.96)×104/cm2;group C:(4.38±1.44)×104/cm2,(6.80±0.85)×104/cm2,(4.94±0.40)× 104/cm2].There were bacterias in group D on postburn day 14,21[(4.10±0.47)×104/cm2,(2.46±0.76)×104/cm2].Among group A,B,C and D,on postburn day 10,14,21,there were significantly statistical difference(P<0.05).Staphylococcus aureus was the most in gram-positive bacteria. Pseudomonas aeruginosa was the most in gram-negative bacteria.The results of susceptibility test indicated that Staphylococcus aureus were resistant to Penicillin G, Ciprofloxacin,Rifampicin,Oxacillin,Ofloxacin,Gen-tamicin,and Teteacycline,while Pseudomo-nas aeruginosa were resistant to Piperacillin,Netilmicin,Cefepime, Piperacillin tazobactam,and Gentamicin.The antimicrobial susceptibility testing:group D>group C>group B>group A.ConclusionrhGM-CSF combined with nano-silver treatment can reduce bacteria growth,improve the antimicrobial susceptibility of pathogens.
Recombinant human Granulocyte-macrophage colony stimulating factor;Nano silver;Burn wound;Pathogen; Drug resistance
R644
A
1673-7210(2014)04(c)-0012-05
2013-11-24本文編輯:衛(wèi)軻)
河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究課題計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào)20130024);河北省承德市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展計(jì)劃(自籌經(jīng)費(fèi))項(xiàng)目(編號(hào)20122164)。
▲共同第一作者
耿琪瑛(1954.2-),女,河北承德人,教授;研究方向:主要從事燒傷創(chuàng)面異體皮應(yīng)用及難愈性創(chuàng)面治療的研究。
中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)2014年12期