周細秋，舒祥兵，張靜喆，郭修田，許陽賢，陸金根，季 光

脾虛證結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織中5-羥色胺受體1F表達差異的研究

周細秋1,2，舒祥兵3，張靜喆1,2，郭修田1,2，許陽賢1，陸金根1,2，季 光3

目的：探討脾虛證結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織5-羥色胺受體1F（5-HTR1F）的表達差異并探討其可能的臨床意義。方法：中醫(yī)辨證符合脾虛證的結(jié)腸癌患者32例為研究組，以18例同期濕熱證結(jié)腸癌患者為對照組，SP免疫組化檢測兩組病例結(jié)腸癌組織和相鄰結(jié)腸黏膜組織5-HTR1F的表達。結(jié)果：兩組患者腫瘤組織中5-HTR1F的陽性表達率為74.4%，其相鄰的結(jié)腸黏膜組織中5-HTR1F的陽性表達率為24.3%，兩組表達有顯著差異；脾虛證患者腫瘤組織中5-HTR1F的陽性表達率為87.5%，濕熱證患者腫瘤組織中5-HTR1F的陽性表達率為55.6%，兩組表達有顯著差異，在不同TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論：5-HTR1F的表達可能與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并可作為結(jié)腸癌脾虛證的預(yù)測指標。

結(jié)腸癌；脾虛證；5-羥色胺受體1F；臨床病理

結(jié)腸癌根治術(shù)后5年生存率約為50%[1]，脾虛是結(jié)腸癌常見的臨床證侯[2]。5羥色胺受體（5-hydroxytryptamine,5-HTR）多個亞型在肝癌、乳腺癌等惡性腫瘤中的作用已較明確，但在結(jié)腸癌中作用還不明確[3]。2010年1月—2012年12月，我們著手于大腸癌脾虛證的研究，探討5羥色胺受體家族新成員5-HTR1F在病變和正常結(jié)腸組織中的表達，為闡明大腸癌脾虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)提供臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究共納入對象50例，分為研究組和對照組，均行結(jié)腸癌根治術(shù)，術(shù)中切取腸癌組織標本和相鄰部位正常腸組織標本。研究組為中醫(yī)辨證屬脾虛證型，共32例，其中男21例，女11例；年齡46～82歲，平均（68±9.4）歲，中位年齡63歲。病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者9例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者23例。高分化腺癌9例，中分化腺癌17例，低分化腺癌6例。TNM分期I～Ⅱ期20例，III～Ⅳ期12例。對照組為中醫(yī)辨證濕熱證，共18例，男11例，女7例；年齡43～84歲，平均（64.6±10.2）歲，中位年齡61歲。病理證實有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者8例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例。高分化腺癌5例，中分化腺癌9例，低分化腺癌4例。TNM分期I～Ⅱ期11例，III～Ⅳ期7例。兩組性別、年齡、病理類型、TNM分期均無統(tǒng)計學(xué)差異。

1.2 方法 所有標本采用4 μm連續(xù)石蠟切片，采用SP免疫組織化學(xué)法檢測。羊抗人5-HTR1F多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP免疫組織化學(xué)試劑盒購自福州邁新公司，染色程序按試劑盒說明書進行。主要步驟：切片常規(guī)脫蠟至水，高溫高壓組織抗原修復(fù)，5-HTR1F多克隆抗體按1∶200稀釋，DAB顯色。常規(guī)復(fù)染封片，結(jié)果用彩色病理圖像分析系統(tǒng)采集。以細胞質(zhì)、核膜或胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，每張切片觀察10個不同視野（上3，中4，下3），計數(shù)陽性細胞占所有細胞的百分數(shù)。按陽性細胞數(shù)＜5%為（-），5～10%為弱陽性（+），11～50%為中等陽性（++），＞50%為強陽性（+++）。以陽性表達為+～+++的例數(shù)占所在分組總例數(shù)的百分比（%）作為該組的陽性表達率,。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Stata 7.0統(tǒng)計軟件處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 5-HTR1F在結(jié)腸癌黏膜組織中的表達 50例入選對象的結(jié)腸癌黏膜組織中5-HTR1F的陽性表達率為74.4%，多為中等或強陽性表達（圖1A）。而與相鄰的癌旁腸黏膜組織中陽性表達率為24.3%，以不表達或弱陽性表達為主（圖1B）。結(jié)腸癌患者黏膜組織5-HTR1F的陽性表達率顯著高于癌旁腸黏膜組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示5-HTR1F可能在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用（見圖1）。2.2 5-HTR1F表達與結(jié)腸癌臨床病理之間的關(guān)系不同性別、年齡、腫瘤部位、病理類型、分化程度癌組織5-HTR1F的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。TNM分期Ⅰ～Ⅱ期和III～Ⅳ期5-HTR1F表達陽性率分別為29%和79%（P＜0.05）。有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5-HTR1F表達陽性率分別為88%和30%（P＜0.05）。腫瘤浸潤全層及漿膜5-HTR1F表達陽性率為85%，明顯高于腫瘤浸潤黏膜、肌層的62.5%（P＜0.05）。提示5-HTR1F的表達可能與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度相關(guān)（表1）。2.3 5-HTR1F表達與結(jié)腸癌患者證侯表型的關(guān)系32例脾虛證結(jié)腸癌黏膜組織中有28例5-HTR1F表達為陽性，陽性表達率為87.5%（n=32），以中等或強陽性表達居多（圖1C）。18例濕熱證結(jié)腸癌黏膜組織中有10例5-HTR1F表達為陽性，陽性表達率為55.6%（n=18），以弱陽性表達為主（圖1D）（P＜0.05）。提示5-HTR1F在脾虛證和濕熱證患者存在表達差異（圖1，表2）。

表1 5-HTR1F表達與結(jié)腸癌臨床病理的關(guān)系（n=50）

表2 不同證型結(jié)腸癌組織中5-HTR1F的陽性表達

圖1 5-HTR1F在大腸癌組織和正常組織的表達（SP法×400倍，箭頭示陽性表達）

3 討論

腫瘤發(fā)生是一個復(fù)雜的過程，除了基因和表觀遺傳學(xué)改變[4]的因素之外，社會心理因素與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也存在著一定的聯(lián)系[3]。循證醫(yī)學(xué)研究分析發(fā)現(xiàn)，社會心理因素與腫瘤發(fā)生率及生存率有著密切聯(lián)系[5]。但慢性應(yīng)激與腫瘤發(fā)生之間聯(lián)系的具體機制仍不十分明確。

5-HT是一種常見神經(jīng)遞質(zhì)，通過其受體5HTR介導(dǎo)應(yīng)激的發(fā)生，同時也是一種重要的胃腸激素，調(diào)控著消化道的分泌、運動、吸收及細胞營養(yǎng)等功能。腸道黏膜在受到刺激時可引起5-HT的釋放，作用于腸黏膜上的5-HTR而發(fā)生作用[6]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，5-HT與胃腸道腸易激綜合癥、腹瀉等多種疾病的發(fā)生有關(guān)[6-7]。5-HT有多個受體亞型，近年來的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)5-HTR1A、5-HTR1B、5-HTR1D和5-HTR2A在乳腺癌、前列腺癌和膀胱癌高表達[5]。但是5-HTR與腸癌發(fā)生的關(guān)系一直沒有明確，作為5-HTR家族的新成員，5-HTR1F與腫瘤發(fā)生是否有關(guān)也尚存在爭議，需更高級別的研究證據(jù)的支持。

脾虛是結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的重要中醫(yī)病理因素，研究表明健脾治療可以提高化療對大腸癌術(shù)后患者的總體療效[2]。既往的動物實驗表明脾虛時胃竇及十二指腸組織的5-HT細胞數(shù)目增多，5-HT及5-HTR含量會增加；運用健脾益氣的方藥治療后，大鼠的脾虛癥狀改善較明顯，其胃腸道內(nèi)源性5-HT及5-HTR含量也相應(yīng)減少[7]。本研究中選擇了脾虛證的結(jié)腸癌患者，并以同期濕熱證大腸癌患者為對照，比較了腫瘤組織、正常組織5-HTR1F的表達，發(fā)現(xiàn)了脾虛證患者結(jié)腸癌黏膜組織5-HTR1F陽性表達率顯著高于同期濕熱證患者，進一步提示5-HTR1F有望作為結(jié)腸癌脾虛證患者的生物標志物，對中醫(yī)脾虛證的臨床辨證的客觀化，指導(dǎo)結(jié)腸癌患者的辨證用藥和療效評價具有一定意義，值得進一步深入研究。

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[2]董靜波,李雁,翁國愛,等.化療結(jié)合益氣健脾法治療大腸癌術(shù)后患者的臨床研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2011,29(1):21-27.

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（收稿：2013-12-06 修回：2014-05-12）

（責任編輯 周振理）

Expression of Serotonin Receptor(5-HTR1F)in Patients with Colon Cancer Differentiated as Deficien-cy in Spleen Qi according to TCM

ZHOU Xi-qiu,SHU Xiang-bing,ZHANG Jing-zhe,et al.Department of surgery,Longhua Hospital,Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai(200032),China

Objective To explore the expression and role of Serotonin receptor(5-HTR1F)in the tissue of human colon cancer with deficiency in spleen qi.MethodsThe expression of 5-HTR1F was detected by SP immunohistochemistry.ResultsAmong the 5-patients with colon cancer underwent radical resection,32 patients were with syndrome of deficiency of spleen qi,18 patients were with syndrome of dampness-heat.The expression of 5-HTR1F was significantly different between patients with deficiency of spleen qi and patients with syndrome of dampness-heat.The difference had a statistical significance in the TNM pathological classification, lymph node metastasis and depth of invasion.ConclusionThe expression of 5-HTR1F may be associated with the development of colon cancer and be used as the prediction index of human colon cancer for those with deficiency in spleen qi.

Colon cancer;deficiency of spleen qi;5-hydroxytryptamine receptor 1F;clinical pathology

R735.3+5

A

1007-6948(2014)03-0234-03

10.3969/j.issn.1007-6948.2014.03.003

上海市衛(wèi)生與計劃生育委員會資助（2012L029A）;顧氏外科流派建設(shè)項目（ZYSNXD-CC-APGC-JD002）

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院外科（上海 200032）

2.上海中醫(yī)藥大學(xué)外科研究所（上海 200032）

3.上海中醫(yī)藥大學(xué)脾胃病研究所（上海 200032）

季光,E-mail：jiliver@vip.sina.com