韓永剛陳忠壽黃風(fēng)云

牙周炎齦溝液中HMGB1、2的表達(dá)及意義*

韓永剛①陳忠壽①黃風(fēng)云①

目的：探討HMGB1、HMGB2與NO在牙周炎發(fā)病中的相關(guān)性，以了解HMGB1、HMGB2在牙周炎發(fā)病中可能的生物學(xué)作用。方法：選取2012年3月-2014年3月本院牙科收治的106例牙周炎患者作為試驗(yàn)組，另外選取本院牙齒健康體檢者58例作為對(duì)照組。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定HMGB1、HMGB2及硝酸還原法測(cè)定NO在齦溝液中的含量，分析HMGB1、HMGB2與NO在牙周炎齦溝液中的相關(guān)性。結(jié)果：兩組HMGB1、HMGB2和NO三個(gè)指標(biāo)的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表示HMGB1、HMGB2和NO三個(gè)指標(biāo)在牙周炎齦溝液中的表達(dá)與正常人比較異常增高。HMGB1和HMGB2與NO的水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)分別為r=0.875、0.848（P＜0.05），均呈正相關(guān)。結(jié)論：HMGB1、HMGB2可能是牙周炎中的重要炎因子之一。

牙周炎； 齦溝液； 高遷移率蛋白； 一氧化氮

牙周炎是患者牙周部位受到感染時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗感染作用時(shí)導(dǎo)致牙周炎癥介質(zhì)及毒性自由基聚集所引起的一系列炎癥感染癥狀。牙周炎通常為慢性炎癥逐漸發(fā)展為急性炎癥，也就是牙周炎的活躍期[1-2]。牙周炎可侵犯牙周組織，造成炎癥破壞性疾病，主要為牙周袋及袋壁的炎癥，從而導(dǎo)致牙槽骨吸收及牙齒逐漸松動(dòng)甚至脫落，牙周炎是導(dǎo)致成年人缺牙的主要原因，其主要的炎癥反應(yīng)是過(guò)度的機(jī)體免疫反應(yīng)所造成的自我破壞[3-4]。研究牙周炎的炎癥因子HMGB1、HMGB2與NO發(fā)病中的作用有重要的意義。故本文通過(guò)ELISA檢測(cè)牙周炎患者齦溝液中HMGB1、HMGB2與NO的表達(dá)量，可通過(guò)相關(guān)回歸曲線分析它們的關(guān)系，了解其與牙周炎發(fā)病進(jìn)展中可能存在的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年3月-2014年3月本院牙科收治的106例牙周炎患者作為試驗(yàn)組，患者牙頸部無(wú)齲損、無(wú)充填體，平均年齡（42±12）歲。另外選取本院牙齒健康體檢者58例作為對(duì)照組，所有體檢者均為未發(fā)生過(guò)牙周疾病人群，平均年齡（24±5）歲，不吸煙，未妊娠，至少1個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)抗生素及非甾體抗炎藥或者其他影響白細(xì)胞的藥物，與其簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 每2 mm×10 mm濾紙條放入一個(gè)微離心管中進(jìn)行消毒干燥，在電子天平上稱重并記錄備用。去除齦溝液收集部分的齦上菌斑，棉球隔濕后氣槍輕吹待測(cè)牙面，1 min后將濾紙條插入患牙的觀察位點(diǎn)的齦溝，當(dāng)有阻力時(shí)停止，滯留30 s后取出，放入Ep管立即稱重并與收集齦溝液前重量比較，算出齦溝液的重量（mg），按齦溝液密度等于1計(jì)算齦溝液量（mL）。在Ep管中加磷酸鹽緩沖液300 μL，震蕩1 h后取出濾紙條，將標(biāo)本放入-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方法

1.3.1 主要儀器 -20 ℃普通冰箱，離心機(jī)（深圳愛(ài)特爾），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Bio-Tec）。

1.3.2 主 要 試 劑 HMGB1/HMG3/SBP-1/HMG1 （HMGB1）Elisa試劑盒購(gòu)自江蘇省弗泰生物科技有限公司，貨號(hào)：HMGB2/HMGB（HMGB1）Elisa試劑盒購(gòu)自江蘇省弗泰生物科技有限公司，貨號(hào)：HD-HMGB2；一氧化氮Griess Reagent法檢測(cè)試劑盒（NO）（貨號(hào)：S0021，公司：碧云天）。

1.3.3 ELISA檢測(cè)HMGB1和HMGB2在牙周炎齦溝液中的表達(dá)水平 96孔板第一排的8個(gè)孔作為標(biāo)準(zhǔn)孔，按以下濃度：1、5、10、20、30、40、50 μL滴入各標(biāo)準(zhǔn)孔，按50 μL/孔稀釋，第1排的最后一個(gè)孔滴入超純水作為空白對(duì)照，利用標(biāo)準(zhǔn)孔數(shù)據(jù)在Excel下建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將制備的齦溝液回復(fù)常溫后各樣品50 μL加入其余樣品孔，在37 ℃的恒溫箱中反應(yīng)90 min；預(yù)先制備的0.01 M PBS洗板3次，濾紙印干；加入一抗（HMGB1和HMGB2）100 μL，37 ℃恒溫箱中反應(yīng)60 min；0.01 M PBS再次洗板3次，每次浸泡4 min，濾紙印干；加入酶標(biāo)液100 μL，37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min；0.01 M PBS洗板4次，每次浸泡3 min，濾紙印干；加入底物TMB 90 μL，置恒溫箱中37 ℃在暗處反應(yīng)11 min；每孔加入1滴終止液混勻，當(dāng)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色時(shí)上機(jī)檢測(cè)；酶標(biāo)儀設(shè)定450 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.4 齦溝液中一氧化氮的檢測(cè) 取出標(biāo)準(zhǔn)品（1 M NaNO2）和樣品（齦溝液）放置至室溫；將標(biāo)準(zhǔn)品按以下濃度加入標(biāo)準(zhǔn)孔：0、1、2、5、10、20、30、40、50、60、80、100 μM，并稀釋至50 μL/孔。在剩余的樣品孔中加入50 μL/孔的關(guān)節(jié)液樣品；取出Griess Reagent Ⅰ、Ⅱ放置至室溫，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅰ，按50 μL/孔在各孔中加入Griess Reagent Ⅱ；通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)出各標(biāo)準(zhǔn)品及樣品孔的吸光度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線及樣品孔的吸光度求出各樣品的NO濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，其中兩組3個(gè)指標(biāo)組間比較應(yīng)用單因素方差分析；作HMGB1和HMGB2與NO進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較 兩組HMGB1、HMGB2及NO組間比較作單因素方差分析，兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表示HMGB1、HMGB2及NO在牙周炎齦溝液中表達(dá)與正常人的齦溝液比較異常增高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2 CCL1與HMGB2和NO的相關(guān)分析 HMGB1與NO水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.875 （P＜0.05），兩者呈正相關(guān)。HMGB2與NO水平作Spearman相關(guān)分析，相關(guān)系數(shù)為r=0.848（P＜0.05），兩者呈正相關(guān)。

表1 兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較（±s）

表1 兩組HMGB1、HMGB2及NO的比較（±s）

*與對(duì)照組比較，P＜0.05

NO （μmol/L）試驗(yàn)組（n=106）784.94±210.13*824.11±172.72*185.52±55.79*對(duì)照組（n=58）126.86±75.53 110.73±53.38 27.33±19.35組別 HMGB1 （pg/mL）HMGB2 （pg/mL）

3 討論

牙周炎發(fā)病原因是由于牙周的齦溝液中炎癥因子的聚集與形成緊密相關(guān)。正?？谇恢挟a(chǎn)生的NO是由L-精氨酸在一氧化氮合酶的催化下生成L-瓜氨酸時(shí)釋放的。一些研究已證實(shí)NO對(duì)維持口腔內(nèi)正常菌群的平衡以及抗微生物感染有直接影響[5-6]。同時(shí)，適量的NO對(duì)牙周組織的健康及功能的正常發(fā)揮起著重要作用[7-8]。在牙周炎癥狀態(tài)下，血管內(nèi)皮素的含量顯著增高，NO的水平相應(yīng)增高來(lái)對(duì)抗血管內(nèi)皮素所造成的牙周組織小血管及微血管的強(qiáng)烈收縮，在此防御反應(yīng)過(guò)程中，過(guò)量產(chǎn)生的NO使擴(kuò)血管因子與縮血管因子之間的關(guān)系失衡，通過(guò)活化多重級(jí)聯(lián)信號(hào)引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)，促進(jìn)炎癥發(fā)展[9-10]。因此NO在牙周炎發(fā)病過(guò)程中的炎癥作用已不言而喻。然而牙周炎的齦溝液中的炎癥改變是否與HMGB1、HMGB2的炎癥聚集有關(guān)？定量檢測(cè)牙周炎患者的齦溝液中HMGB1、HMGB2的含量是否可以作為牙周炎的診斷指標(biāo)？目前為止尚未有報(bào)道肯定的回答以上兩個(gè)問(wèn)題，以下將對(duì)以上兩個(gè)問(wèn)題展開深入討論。

本實(shí)驗(yàn)的研究證明，HMGB1、HMGB2及NO在牙周炎患者的齦溝液中表達(dá)較正?；颊咴龈撸梢哉f(shuō)明HMGB1、HMGB2及NO均為牙周炎的炎癥因子之一，與其他報(bào)道結(jié)果基本相符[11-13]。從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)上可發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組齦溝液中HMGB1、HMGB2及NO的表達(dá)數(shù)據(jù)均明顯高于對(duì)照組，更進(jìn)一步的說(shuō)明了HMGB1、HMGB2及NO與牙周炎的發(fā)病密切相關(guān)。對(duì)于健康人群的牙周齦溝液的檢測(cè)中可看出HMGB1、HMGB2 及NO的表達(dá)量相對(duì)較低，從過(guò)去的報(bào)道中可知[14-15]。這表明可能在低含量的HMGB1、HMGB2及NO情況下不會(huì)形成牙周炎。

由上述可知，NO因濃度不同而具有不同的生物學(xué)作用，低濃度時(shí)可擴(kuò)血管、抗菌的作用，可促進(jìn)口腔健康，而高濃度時(shí)可促牙周炎癥形成及牙周組織破壞的作用。本研究發(fā)現(xiàn)HMGB1和HMGB2與NO均成正相關(guān)關(guān)系，由此可表明HMGB1和HMGB2均可促進(jìn)KOA的局部炎癥形成，進(jìn)而可能參與牙周組織的破壞。

綜上所述，HMGB1和HMGB2可能是炎癥因子NO的協(xié)同作用因子，其可促進(jìn)牙周局部炎癥形成。探討HMGB1和HMGB2拮抗劑進(jìn)一步地了解HMGB1和HMGB2在牙周炎中的作用機(jī)制，更能為臨床治療牙周炎提供新的靶向治療方向。

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Expression and Significance of HMGB1，2 of the Gingival Crevicular Fluid of Periodontitis

/HAN Yonggang，CHEN Zhong-shou，HUANG Feng-yun.//Medical Innovation of China，2014，11（21）：083-085

Objective：To investigate the correlation between HMGB1， HMGB2 and NO in the onset of periodontitis，to understand the possible biological role of HMGB1，HMGB2 in the pathogenesis of periodontitis.Method：160 patients with periodontitis in dental department from March 2012 to March 2014 were selected as the experimental group，in addition teeth healthy subjects in our hospital were selected as the control group.Enzyme linked immunosorbent assay was used to detect the expression of HMGB1，HMGB2 and NO in gingival crevicular fluid.The correlation of HMGB1，HMGB2 and NO were analyzed in the periodontitis of gingival crevicular fluid.Result：The experimental group compared with the control group had statistical significance in the HMGB1，HMGB2 and NO（P＜0.05）.It showed that HMGB1，HMGB2 and NO expression in periodontitis gingival crevicular fluid compared with normal people in gingival crevicular fluid were abnormal increased.Spearman correlation analyzed for the expression levels of HMGB1，HMGB2 and NO.The correlation coefficients were r=0.875，0.848（P＜0.05），positived correlation.Conclusion：HMGB1，HMGB2 is one of important inflammatory factors in periodontitis.

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.21.027

2014-04-11） （本文編輯：歐麗）

2012年深圳市龍崗區(qū)科技項(xiàng)目（YS2013189）

①?gòu)V東省深圳市龍崗區(qū)南灣人民醫(yī)院 廣東 深圳 518114

韓永剛

【Key words】Periodontitis； Gingival crevicular fluid； High mobility protein； Nitric oxide

First-author’s address：Nanwan People’s Hospital of Longgang District in Shenzhen City，Shenzhen 518114，China