張瓊王莉莉楊利紅

耐STI571的K562細(xì)胞株的建立及生物學(xué)特性考察

張瓊①王莉莉②楊利紅①

目的：建立1株耐STI571的K562細(xì)胞，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行研究分析，探討耐藥機(jī)理。方法：通過(guò)遞增STI571藥物濃度的方法，成功建立1株耐STI571人白血病細(xì)胞株K562/R，并采用RT-PCR﹑Western-blot﹑免疫組化﹑基因測(cè)序等生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行耐藥機(jī)理進(jìn)行分析。結(jié)果：K562/R細(xì)胞株在STI571濃度高達(dá)1 μmol/L水平，仍能穩(wěn)定生長(zhǎng)，繁殖旺盛。K562/R細(xì)胞株耐STI57程度較親代K562細(xì)胞多達(dá)235倍，該耐藥細(xì)胞株對(duì)HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐藥性，與親代K562細(xì)胞比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與親代敏感株K562細(xì)胞相比，其BCR-ABL基因表達(dá)上調(diào)，BCR-ABL蛋白及其激酶過(guò)度表達(dá)。結(jié)論：成功建立耐STI571人白血病細(xì)胞株K562/R，并對(duì)其生物學(xué)特性的研究，為STI571耐藥機(jī)制的進(jìn)一步深入研究和抗耐藥抑制劑的篩選提供了有效的平臺(tái)。

K562； STI571； 耐藥； BCR-ABL

白血?。╨eukemia），俗稱的血癌，是由多種病因誘發(fā)的一類造血干細(xì)胞克隆性惡性疾病，國(guó)內(nèi)的發(fā)病率約為10萬(wàn)分之2.76，為兒童和35歲以下成人死亡的主要病因[1-2]。慢性髓性白血?。–ML）是一種起源于造血干細(xì)胞的惡性增生性疾病，臨床上分期有慢性期﹑加速期和急變期[3]。該疾病，主要是由于BCRABL基因的變異致使BCR-ABL融合蛋白的異常表達(dá)，進(jìn)而使得細(xì)胞分裂的方式不再受正?？刂?，促使白細(xì)胞的異常增殖進(jìn)而導(dǎo)致該疾病的發(fā)生[4-5]。CML在國(guó)內(nèi)占各類白血病的15%～20%，占各種慢性病的95%，病程一般持續(xù)4年左右，隨著疾病進(jìn)展對(duì)治療的逐漸不敏感，因此該疾病對(duì)我國(guó)人口健康造成了很大的危害[6]。

STI571，商品名為格列衛(wèi)（Glivec或Gleevec）為近年來(lái)開發(fā)的基因靶向治療藥物，根據(jù)CML的分子發(fā)病機(jī)制，以BCR-ABL蛋白激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，人工合成了ABL激酶的ATP結(jié)合位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，是針對(duì)CML特異的分子異常進(jìn)行的一種靶向分子藥物。盡管大多數(shù)CML患者對(duì)STI571具有明顯的血液和細(xì)胞遺傳學(xué)反應(yīng)，但相當(dāng)一部分患者，尤其是加速期和急變期患者對(duì)STI571產(chǎn)生了原發(fā)或獲得性耐藥，在臨床上嚴(yán)重影響了該藥的治療效果，從而約束了STI571的應(yīng)用[7-8]。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立耐STI571的K562細(xì)胞株，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行考察，研究其致病機(jī)理。研究FDB聯(lián)合STI571誘導(dǎo)K562細(xì)胞耐藥性的差異，并對(duì)其治療效果進(jìn)行研究分析，探討耐藥機(jī)理，為抗耐藥的治療途徑及開發(fā)新的治療藥物提供一些參考和思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用細(xì)胞 人白血病細(xì)胞株K562（購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 耐STI571細(xì)胞株建立 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，通過(guò)逐漸遞增STI571的濃度，誘導(dǎo)在1 μmol/L STI571的條件下，穩(wěn)定生長(zhǎng)，快速增殖的細(xì)胞株命名為K562/R細(xì)胞株。

1.2.2 MTT法測(cè)定K562/R細(xì)胞對(duì)STI571及常見化療藥物的IC50 取脫離STI571培養(yǎng)2周的K562/ R細(xì)胞和敏感株K562細(xì)胞接種于96孔板，加入以RPMI1640培養(yǎng)稀釋的不同濃度的STI571，以相同體積的培養(yǎng)液為空白對(duì)照，通過(guò)MTT法測(cè)定藥物的抑制率，并計(jì)算其對(duì)STI571的IC50。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)K562/R細(xì)胞BCR-ABL基因的表達(dá)及序列分析 提取K562/R細(xì)胞總RNA并對(duì)其量和純度進(jìn)行鑒定，反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增BCR-ABL基因，對(duì)BCR-ABL擴(kuò)增產(chǎn)物回收并測(cè)序。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）測(cè)定K562/R細(xì)胞BCR-ABL蛋白及其酪氨酸激酶的表達(dá) 提取K562/R細(xì)胞總蛋白，采用Lowry法測(cè)定蛋白濃度，將轉(zhuǎn)移至膜的BCR-ABL蛋白用ALPHA INNOTECH化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描，以各組目的蛋白條帶光密度值對(duì)內(nèi)參蛋白光密度值計(jì)算相對(duì)比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 K562/R細(xì)胞的獲得 通過(guò)遞增STI571的濃度，經(jīng)13個(gè)月，誘導(dǎo)出在1 μmol/L STI571的條件下穩(wěn)定生長(zhǎng)的K562/R細(xì)胞株。1 μmol/L STI571作用48 h后的K562敏感細(xì)胞株形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞膜皺縮，胞漿顆粒增多，增殖減慢；而相同濃度STI571作用下的K562/R細(xì)胞，其輪廓清晰，胞體圓形透明，生長(zhǎng)旺盛，見圖1。

2.2 MTT法測(cè)定K562/R細(xì)胞對(duì)STI571及常見化療藥物的IC50 為了明確K562/R細(xì)胞對(duì)STI571的耐藥倍數(shù)，應(yīng)用MTT法觀察了K562和K562/R細(xì)胞對(duì)STI571的IC50值，分別為（0.01±0.005）μmol/L﹑（2.35±0.01）μmol/L。K562/R細(xì)胞耐藥倍數(shù)為K562細(xì)胞的235倍，K562/R與其親本細(xì)胞K562在抵抗STI571的作用上比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而K562/R細(xì)胞亦對(duì)HHT﹑VCR﹑DNR表現(xiàn)出不同的交叉耐藥性，與K562比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表1。

圖1 K562/R細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株光學(xué)顯微鏡下表現(xiàn)形態(tài)

表1 K562/R細(xì)胞株和敏感細(xì)胞株交叉耐藥性

2.3 RT-PCR檢測(cè)K562/R細(xì)胞BCR-ABL基因的表達(dá) RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞與不同耐藥程度K562細(xì)胞（0.3 μmol/L﹑0.6 μmol/L﹑0.9 μmol/L﹑1 μmol/L）的BCR-ABL cDNA，可見熒光條帶，針對(duì)BCR-ABL融合基因的引物擴(kuò)增出862 bp大小的片段，顯示各組細(xì)胞均為BCR-ABL融合基因陽(yáng)性。電泳檢測(cè)RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以200 bp的GAPDH為內(nèi)參。半定量PCR灰度掃描不同耐藥程度K562細(xì)胞的光密度與其內(nèi)參的比值分別為（1.97±0.05）﹑（2.14±0.09）﹑（3.21±0.21）﹑（4.05±0.19）﹑（4.77±0.18），BCR-ABL的 mRNA水平隨耐藥程度的增加而增加，K562/R細(xì)胞的BCRABL基因表達(dá)上調(diào)，見圖2。

圖2 K562/R細(xì)胞BCR-ABL基因的表達(dá)

2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）測(cè)定K562/R細(xì)胞BCR-ABL蛋白的表達(dá) 采用Western blot方法檢測(cè)K562細(xì)胞與不同耐藥程度K562/R細(xì)胞的BCR-ABL融合蛋白，灰度掃描BCR-ABL融合蛋白與β-actin蛋白比值為（0.043±0.020）﹑（0.045±0.010）﹑（0.26±0.04）﹑（0.937±0.020）﹑（0.97±0.01），K562敏感細(xì)胞與不同耐藥程度的K562/R細(xì)胞的BCR-ABL蛋白表達(dá)量比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），K562/R細(xì)胞BCRABL蛋白過(guò)度表達(dá)，見圖3；進(jìn)一步用Tyr抗體對(duì)BCR-ABL激酶表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果為（0.0370±0.0061）﹑（0.0390±0.0045）﹑（0.230±0.047）﹑（0.350±0.053）﹑（0.410±0.026），K562/R細(xì)胞BCR-ABL激酶過(guò)度表達(dá)，激酶表達(dá)隨耐藥程度的增加而增加。

圖3 Western blot測(cè)定K562/R細(xì)胞BCR-ABL蛋白的表達(dá)

3 討論

CML患者有90%以上存在特征性的pH染色體及BCR-ABL融合基因，其治療關(guān)鍵是在慢性期能否夠獲得分子水平的緩解。STI571是一種針對(duì)CML的靶向藥物，該類酪氨酸激酶抑制劑，為CML的治療帶來(lái)了希望[9]。然而，CML患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的治療反應(yīng)與個(gè)體BCR-ABL基因變異密切相關(guān)，另外在CML的治療過(guò)程中，研究人員和醫(yī)療人員發(fā)現(xiàn)，使用STI571治療數(shù)周或者數(shù)月內(nèi)，多數(shù)患者出現(xiàn)了不同程度的耐藥性，同時(shí)臨床上STI571的使用頻率不斷增加，目前STI571引起的耐藥性問題越來(lái)越嚴(yán)重[10-11]。在耐藥和復(fù)發(fā)性CML患者中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100種BCR-ABL基因的突變[12]。這些變異干擾激酶抑制劑的親和力，同時(shí)也改變了BCR-ABL的生物學(xué)功能，其中有些變異具有廣泛耐藥行性，是目前臨床上最難以克服的一種基因突變[13-15]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)逐步增加STI571濃度的作法，最終得到了與敏感細(xì)胞相比耐藥倍數(shù)為235倍的K562/R細(xì)胞株，該細(xì)胞在STI571作用下，細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯改變，生長(zhǎng)穩(wěn)定，增殖迅速；繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，K562/R細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)與正常K562細(xì)胞沒有太大差異。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)到K562/R細(xì)胞BCR-ABL基因mRNA水平升高，其編碼的BCR-ABL蛋白過(guò)度表達(dá)，致使BCR-ABL激酶重新活化，過(guò)度增殖，表明BCRABL基因及其表達(dá)產(chǎn)物與CML的STI571耐藥密切相關(guān)。在對(duì)耐藥細(xì)胞交叉耐藥性的檢測(cè)，表明耐藥細(xì)胞對(duì)HHT﹑VCR﹑DNR具有不同程度的交叉耐藥性，與敏感細(xì)胞株相比具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），BCR-ABL基因和表達(dá)產(chǎn)物與其他藥物的耐藥性可能存在相關(guān)性，相應(yīng)結(jié)果和結(jié)論還有待于進(jìn)一步探討和驗(yàn)證[16-20]。

綜上所述，本研究成功建立的K562/R細(xì)胞株，為STI571耐藥機(jī)制的研究和抗耐藥抑制劑的體外篩選提供了有效的實(shí)踐平臺(tái)。初步分析了BCR-ABL基因及其表達(dá)產(chǎn)物與CML的STI571耐藥和交叉耐藥性的相關(guān)性。雖然STI571產(chǎn)生了耐藥，但相信隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展以及輔助設(shè)計(jì)的深入，耐藥機(jī)制謎團(tuán)的進(jìn)一步解釋，在CML治療過(guò)程中患者對(duì)酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性最終會(huì)得到解決。同時(shí)由于STI571的出現(xiàn)開創(chuàng)了靶標(biāo)藥物的新時(shí)代，結(jié)合高通量篩選﹑分子模擬和各種生物技術(shù)在藥物研究中的聯(lián)合應(yīng)用，目前已有許多類似新藥帶來(lái)令人振奮的效果，其中AMN107和BMS-354825兩種化合物有望彌補(bǔ)STI571耐藥的缺陷。

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Establishment and Characterization Study of STI571-resistant K562 Cell Line

/ZHANG Qiong，WANG Lili，YANG Li-hong.//Medical Innovation of China，2014，11（16）：001-004

Objective：To establish a STI571-resistant K562 cell line and investigate its biological characteristics and resistance pathogenesis.Method：By incrementing STI571 concentration， a human leukemia cell line K562/R was established successfully， which had strain resistant to STI571， and investigated its biological characteristics and resistance pathogenesis used RT-PCR， Western-blot， immunohistochemistry and gene sequencing.Result：The K562/R cell line was steady growth and exuberant reproduction at the circumstance contained 1 μmol/L STI571. Compared to parental K562 cells， its resistance level to STI57 up to 235 times， at the same time it had varying degrees cross-resistance to HHT，DNR and VCR， compared with K562 cells， the difference was statistically significant （P＜0.05）. Compared with the parental sensitive K562 cells， BCR-ABL gene expression level was raised， BCR-ABL protein and its kinase expression excessive.Conclusion：Successfully establish a STI571-resistant human leukemia cell line K562/R， and investigate its biological characteristics and resistance pathogenesis， those provided an effective platform for further research of STI571 drug resistance mechanism and screening for anti-drug inhibitor.

K562； STI571； Resistance； BCR-ABL

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.16.001

2014-03-28） （本文編輯：蔡元元）

①黑龍江食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)所 黑龍江 哈爾濱 150001

②軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所

楊利紅

First-author’s address：Heilongjiang Institute of Inspection for Food and Drug，Harbin 150001，China