湯恒心曹志愷呂建平

顱內(nèi)靜脈竇血栓形成動物模型建立及治療實(shí)驗(yàn)研究*

湯恒心①曹志愷②呂建平②

目的：通過建立上矢狀竇（SSS）血栓形成的動物模型，并進(jìn)行溶栓、抗凝治療，觀察其治療效果。方法：清潔級青紫藍(lán)大白兔分三組：A組為對照組；B、C兩組分別為經(jīng)頸動脈、SSS溶栓治療組。第一步用可吸收縫線結(jié)扎及用血管夾夾閉SSS制作顱內(nèi)靜脈竇血栓形成（CVST）動物模型，經(jīng)兩種途徑溶栓治療CVST，檢測目標(biāo)靜脈竇血流速度、竇旁腦組織含水量、血流變，隨后進(jìn)行抗凝維持治療。1個月后行DSA及經(jīng)顱多普勒（TCD）檢查。結(jié)果：新動物模型可重復(fù)、穩(wěn)定建立。C組腦組織含水量、基底靜脈血流速度與A、B兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；B、C兩組血流變均有變化，但差異不明顯；C組遠(yuǎn)期靜脈竇血流再通比例優(yōu)于B組。結(jié)論：該動物模型模擬SSS血栓形成，可滿足CVST實(shí)驗(yàn)研究的需要；直接靜脈竇途徑溶栓治療CVST近、遠(yuǎn)期效果優(yōu)于經(jīng)頸動脈途徑溶栓。

顱內(nèi)靜脈竇血栓形成； 動物模型； 介入溶栓； 腦組織含水量

顱內(nèi)靜脈竇血栓形成（CVST）直接介入溶栓治療在臨床廣泛應(yīng)用。為此，通過一種新方法建立動物模型，并進(jìn)行溶栓治療比較實(shí)驗(yàn)，隨后維持抗凝治療，以此觀察近、遠(yuǎn)期治療效果，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 健康青紫藍(lán)大白兔48只，雌雄不限，體質(zhì)量（2.28±0.22）kg，分為三組，其中A組24只為對照組，B組12只、C組12只，分別為經(jīng)頸動脈、SSS注射尿激酶溶栓治療組。

1.2 CVST模型的建立 臀部肌肉注射全身麻醉（速眠新與氯胺酮2：1混合，按0.3 mL/kg劑量注射）。頭部正中切開頭皮約3 cm，分離皮下組織至骨膜，矢狀縫旁顱骨鉆孔，擴(kuò)大骨窗至25 mm×10 mm，暴露SSS，用血管夾（15 g力、尖口8、鈍緣，上海醫(yī)療器械有限公司出品）在SSS前1/3段夾住，后1/3段用5號可吸收縫線（馬克瑞，21～28 d失去張力，60～90 d分解，淮陰醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)）結(jié)扎，用顯微注射器穿刺SSS（前2/3段）腔內(nèi)緩慢注射腦磷脂白陶土懸液100 μL，血栓形成后松開血管夾，縫合頭皮手術(shù)切口，TCD測定SSS血流速度（其中3例探查失敗）。所有模型建立后實(shí)驗(yàn)動物均經(jīng)頸動脈穿刺插管行DSA檢查（其中5例穿刺或造影失?。?。

1.3 神經(jīng)行為學(xué)、病理生理學(xué)觀察 觀察臨床表現(xiàn)及病理、生理學(xué)的改變：所有實(shí)驗(yàn)動物在栓塞手術(shù)及檢查過程中股動脈插管監(jiān)測動脈血壓、心率、呼吸。栓塞后8 h內(nèi)取少許腦組織，應(yīng)用4%多聚甲醛液固定標(biāo)本、脫水、透明、石蠟包埋、切片及HE染色，光鏡觀察。

1.4 試驗(yàn)性治療 （1）B組用靜脈留置針頭穿刺頸動脈，經(jīng)連接管緩慢注射尿激酶0.4萬U/（kg·d），共5 d；（2）C組穿刺SSS前1/3，用27號顯微注射器向SSS腔內(nèi)緩慢注射尿激酶0.4萬U/（kg·d），共5 d，同時植入微導(dǎo)絲反復(fù)通過SSS栓塞的部分；（3）A組靜脈竇血栓形成后經(jīng)頸動脈注射生理鹽水作為對照；（4）所有實(shí)驗(yàn)動物在溶栓之后繼續(xù)注射肝素3周[經(jīng)頸外靜脈插管泵入肝素2 mg/（kg·d）]；（5）所有實(shí)驗(yàn)動物在肝素注射結(jié)束之后繼續(xù)口服華法令1周，0.05 mg/（kg·d）。

1.5 療效指標(biāo)檢測 （1）取對照組血栓形成前、后及溶栓結(jié)束后三組各8只，切取縫線與血管夾中間竇旁腦組織0.2～0.3 g，測定腦組織含水量；血栓形成后8 h，腦水腫程度最高；（2）分別于栓塞前、后及治療結(jié)束后2 h，用TCD （EME TC8080 2 MHz低頻探頭）經(jīng)頭皮測SSS血流及BV的血流速度；促凝物質(zhì)注射5 h后血栓基本形成，模型建立后120 min腦血流相對穩(wěn)定；（3）分別于栓塞前、后1 h及溶栓治療結(jié)束后2 h，抽外周靜脈血測血流變；模型建立后1 h、溶栓2 h后凝血狀態(tài)基本穩(wěn)定；（4）1個月后取三組實(shí)驗(yàn)動物行DSA及TCD檢查。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較用單因素方差分析，兩組之間比較采用SNK檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 CVST動物模型制作的臨床和病理改變 SSS栓塞后血流消失（圖1），竇旁腦組織變灰、白色或紫色，或皮質(zhì)滲血，同時出現(xiàn)癱瘓、食欲減退、反應(yīng)遲鈍、肢體抽搐、昏睡等臨床表現(xiàn)。光鏡下觀察：竇及引流靜脈血栓形成、神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞濁脹、變性、壞死，腦溝變淺、平，血管周圍間隙增大，基質(zhì)疏松。

圖1 SSS血栓形成后造影檢查（側(cè)位片，未減影）

2.2 CVST動物模型生理參數(shù)的監(jiān)測 在開顱解剖、結(jié)扎、夾閉上矢狀竇時均出現(xiàn)血壓升高，心率、呼吸增快表現(xiàn)，約30～120 min后恢復(fù)正常，統(tǒng)計(jì)顯示，這些值均在正常生理范圍內(nèi)波動，不會出現(xiàn)休克、腦出血、心律失常、呼吸衰竭等癥狀。

2.3 SSS及BV血流（速度）的變化 SSS血栓形成后DSA顯示SSS完全閉塞（圖1），TCD示血流頻譜無波動（圖2）；BV血流速度增快，為（53.3±3.8）cm/s，溶栓后均有下降（圖3）；C組平均血流速度為（39.1±2.9）cm/s，低于B組的（47.6±3.6）cm/s，更低于A組的（52.6±4.8）cm/s，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且B組與A組比較差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 腦含水量的變化 A組血栓形成前腦組織含水量為（77.6±0.4）%，血栓形成后明顯升高，為（82.6±0.5）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C腦組織含水量為（78.8±0.4）%， 低 于B組 的（82.3±0.6）%及A組 的（82.5±0.4）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B組與A組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 SSS栓塞后血流變各項(xiàng)指標(biāo)變化 SSS栓塞后血流變各項(xiàng)指標(biāo)均比術(shù)前高。C組血流變均有所降低，B組也可見明顯降低，A組血流變無明顯改變；B、C兩組與A組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；但B、C兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

圖2 栓塞后上矢狀竇血流TCD圖

圖3 再通后上矢狀竇血流TCD圖

2.6 DSA檢查 經(jīng)靜脈竇溶栓、抗凝結(jié)束后1個月行DSA檢查，C組8只見SSS血流完全再通（圖4），2只部分充盈缺損或部分血流，1只見線狀血流，1只見SSS仍然閉塞；B組中4只見SSS血流完全再通，4只有部分充盈缺損或部分血流，2只見線狀血流，2只見SSS仍然閉塞；A組18只SSS完全閉塞，2支有部分充盈缺損或部分血流，2只見SSS血流完全再通（自溶），2支顯影欠佳無法診斷。

表1 各組溶栓后血液流變學(xué)結(jié)果（－x±s）

2.7 TCD檢查 經(jīng)靜脈竇直接溶栓、抗凝結(jié)束后1個月行TCD檢查，C組10只見SSS血流再通條帶狀低流速、低波動的血流信號，正弦曲線波形（圖4），2只未見波形；B組中6只見SSS血流完全再通波形，6只未見波形；A組22只顯示SSS血流完全中斷無正常頻譜波形，2只TCD探查失敗。

3 討論

3.1 CVST動物模型制作的歷史和現(xiàn)狀 Tang等[1]利用絲線結(jié)扎制作兔的CVST動物模型，結(jié)扎的靜脈竇不能再通，其血流動力學(xué)無法檢測。曹向宇等[2]利用單極電凝SSS制作兔的CVST動物模型，電凝對SSS的損傷影響模型的重復(fù)性和穩(wěn)定性。湯恒心等[3]利用臨時夾閉加促凝法制作家兔CVST的動物模型只適合于急性血栓而不適合慢性血栓、復(fù)發(fā)、血栓殘留。本研究采用SSS夾閉及可吸收縫線結(jié)扎的辦法建立動物模型，監(jiān)測顯示手術(shù)和治療過程中各項(xiàng)生理指標(biāo)穩(wěn)定；同時手術(shù)簡單，結(jié)扎、注射部位固定，重復(fù)性好。文獻(xiàn)[4]報(bào)道應(yīng)用適度張力的血管夾臨時夾閉靜脈竇損傷小，臨床癥狀30～120 min后緩解?？晌湛p線及血管夾阻斷靜脈竇血流促成血栓形成，血管夾松解及可吸收縫線張力解除，為靜脈竇再通提供條件?？晌湛p線的組織相容性好，無不良反應(yīng)，骨窗開顱創(chuàng)傷小，為必要時的去骨瓣減壓預(yù)留了空間，藺志清等[5]于額骨鉆孔切開上矢狀竇置入4 F導(dǎo)管，12例患者在DSA監(jiān)視下用導(dǎo)絲疏通上矢狀竇、左右橫竇，結(jié)果12例患者顱內(nèi)高壓癥狀全部緩解。

3.2 CVST動物模型的試驗(yàn)性治療 曹向宇等[6]實(shí)驗(yàn)證實(shí)經(jīng)頸動脈溶栓治療CVST與抗凝治療相比有明顯的優(yōu)勢效果，雖然靜脈竇仍然閉塞，但癥狀可明顯緩解[7-8]。Nakase等[9]對SSS閉塞大鼠模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，CVST并非單純SSS閉塞，SSS血栓進(jìn)展致皮層引流靜脈血栓形成、回流障礙、毛細(xì)血管灌注壓升高，竇內(nèi)壓力過高時即造成腦滲透性出血[10-11]，經(jīng)頸動脈溶栓治療作用于引流靜脈可緩解癥狀。盡管如此，靜脈竇再通才是治療CVST的理想境界，這些治療包括接觸性溶栓、微導(dǎo)絲碎拴、球囊擴(kuò)張碎拴、支架治療、Rheolytic導(dǎo)管取栓術(shù)等。介入治療可使閉塞的靜脈竇再通，減緩血液淤滯，對總體預(yù)后有益[12]。湯恒心等[3]利用新的CVST動物模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜脈竇途徑接觸性溶栓治療優(yōu)于經(jīng)動脈途徑。吉訓(xùn)明[13]認(rèn)為，CVST初診時很少立即行MRV或者DSA檢查，早期的確診率很低（10%以下），所以臨床上發(fā)現(xiàn)診斷的CVST大多是亞急性或慢性血栓。本實(shí)驗(yàn)阻斷SSS血流3～4周不等時間，然后張力逐漸松解，期間進(jìn)行溶栓、抗凝治療，“逼真”地模擬了臨床上發(fā)現(xiàn)-診斷-治療血栓的病程，這種模型具有高度的仿真性。亞急性、慢性血栓或者急性血栓合并出血無法接受溶栓治療，此時機(jī)械碎拴、破拴成為重要治療手段，可使靜脈竇再通率提高至90%以上，病死率降至5%以下。吉訓(xùn)明等[14]認(rèn)為，機(jī)械碎拴（包括破拴）治療主要用于病程≤1個月、合并出血、抗凝治療無效的CVST患者。本實(shí)驗(yàn)動物模型可以滿足急性期溶栓治療和亞急性、慢性期機(jī)械碎拴治療進(jìn)行基礎(chǔ)和臨床研究的需要。

3.3 CVST動物模型接觸性溶栓效果的評價(jià) 曹向宇等[6]經(jīng)頸動脈溶栓治療兔CVST測定局部腦血流量、腦組織含水量，結(jié)果表明這兩個指標(biāo)評價(jià)療效敏感、可靠。曹向宇等[2]在經(jīng)頸動脈溶栓治療CVST的影像學(xué)及組織病理學(xué)研究中計(jì)算腦循環(huán)時間、計(jì)數(shù)微血管密度評價(jià)治療效果。但是，以上指標(biāo)難以在臨床做對照實(shí)驗(yàn)，腦組織含水量、腦血流都只能反映急性期的改變。在急性期本實(shí)驗(yàn)嘗試用血流變作為比較指標(biāo)。卲晶瑩等[15]研究認(rèn)為，血液流變學(xué)的變化是深靜脈血栓形成和復(fù)發(fā)的因素，可作為監(jiān)測病程、判斷預(yù)后、指導(dǎo)用藥的重要指標(biāo)。林才厚等[16]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，結(jié)扎SSS后血流變各項(xiàng)指標(biāo)升高。本實(shí)驗(yàn)靜脈竇血栓形成、治療后，可以見到血流變改變。文中三組的血流速度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示基底靜脈的血流速度測定具有高度的敏感性和可區(qū)分度；但B、C兩組的各血流變指標(biāo)變化比較差異并不明顯，且A組的血流變指標(biāo)也無明顯改變，提示血流變的測定具有一定的敏感性，但區(qū)分度不高。血液流變學(xué)與腦血流量互相影響，泊甫氏定律闡明，兩者成反比，因此，在臨床上采用活血化淤治療增加腦皮質(zhì)血流量。

DSA作為診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”直接顯示靜脈竇的狹窄程度、充盈缺損等征象，是診斷CVST最確切的手段[13]。薛爽等[17]認(rèn)為，排除年齡、顳窗條件、動脈供血等影響因素，TCD診斷評價(jià)腦靜脈系統(tǒng)疾病有一定的價(jià)值，1999年Stolz等[18]報(bào)道腦靜脈血流速度增加是CVST診斷間接標(biāo)準(zhǔn)。張京芬等[19]將腦靜脈（竇）描述為條帶狀低流速、低波動的血流信號，正弦曲線形，搏動指數(shù)低，音頻信號似耳語，聲音低而均勻平滑，Valsalva試驗(yàn)可確定為靜脈源性。馬欣等[20]認(rèn)為，TCD所顯示的CVST患者BVR或DMCV 血流速度增高及溶栓治療后又降低具有重要意義，且該指標(biāo)具有很高的敏感性，可為早期診斷和療效監(jiān)測提供依據(jù)。腦靜脈TCD不能作為血栓的定位方式或者竇腔內(nèi)的形態(tài)學(xué)觀察。本研究所得的多普勒再通波形與DSA所顯示的靜脈竇再通情形高度一致，是否可作為溶栓治療的評價(jià)手段有待今后進(jìn)一步研究。

[1] Tang W B，Li M X，Li G Q，et al.Changes of mean platelet volume，fibrinogen content and blood rheology in periheral blood of youth patients with cerebral infarction[J].Chin Assoc Pathophysiol，2012，20（2）：390-393.

[2]曹向宇，李寶民，李生，等.經(jīng)頸動脈溶栓治療腦靜脈竇血栓的影像學(xué)及組織病理學(xué)研究[J].中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2008，8（6）：535-538.

[3]湯恒心，王守森，王如密.臨時夾閉加促凝法制作顱內(nèi)靜脈竇血栓形成的動物模型研究[J].中國微侵襲神經(jīng)外科雜志，2009，14 （4）：176-179.

[4]盧利，蘭行簡，王緒凱，等.血管夾對大鼠股動靜脈損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，26（1）：49-52.

[5]藺志清，曹倒俊，崔彥魁，等.上矢狀竇插管溶栓治療顱內(nèi)靜脈竇閉塞性顱內(nèi)壓增高[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2003，8（3）：177-179.

[6]曹向宇，李寶民，李生，等.經(jīng)頸動脈溶栓治療兔腦靜脈竇血栓的實(shí)驗(yàn)研究成果[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86（11）：745-748.

[7] Lin J H，Kwan S Y，Wu D.Cerebral venous thrombosis initially presenting with acute subarachnoid hemorrhage[J].Chin Med Assoc，2006，69（12）：282-285.

[8] Zeller L，Almog Y，Tomer A，et al.Catastrophic thromboses and severe thrombocytopenia during heparin therapy in a patient with antiphospholipid syndrome[J].Clin Rheumatol，2006，25（11）：426-429.

[9] Nakase H，Shin Y，Nakaga W A I，et al.Clinical features of postoperative cerebral venous infarction[J].Acta Neurochir（Wien），2005，147（54）：621-626.

[10] Stolz E，Gerrlets T，Bodeker R H，et al.Intracranial venous hemodynamics is a factor related to a favorable outcome in cerebral venous thrombosis[J].Stroke，2002，33（2）：1645-1650.

[11] Li B M，Cao X Y，Li S，et al.Clinical analysis of endovascular treatment in cerebral venous sinus thrombosis[J].Chinese Modern Disease[J]，2008，8（1）：539-543.

[12] Li B M，Wang J，Li S，et al.Individualized endovascular treatment of cerebral venous sinus thrombosis：analysis of 168 patients [J]. Chinese Medical Journal，2008，8（2）：539-543.

[13]吉訓(xùn)明.顱內(nèi)靜脈竇血栓形成診治需要明確的問題[J].中國腦血管病雜志，2012，9（12）：617-619.

[14]吉訓(xùn)明，凌鋒，賈建平.多途徑聯(lián)合血管內(nèi)治療顱內(nèi)靜脈竇血栓形成[J].中華放射學(xué)雜志，2005，39（1）：87-91.

[15]卲晶瑩，妳惠，趙彬惠，等.深靜脈血栓形成和復(fù)發(fā)患者同型半胱氨酸及血液流變學(xué)指標(biāo)的檢測[J].中國血液流變學(xué)雜志，2008，18（2）：263-264.

[16]林才厚，王守森，張小軍，等.上矢狀竇結(jié)扎后不同程度的顱內(nèi)壓增高對兔凝血功能的影響[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2013，18（5）：286-288.

[17]薛爽，周寶玉，揚(yáng)麗虹，等.TCD對顱內(nèi)靜脈血流的檢測[J].臨床超聲學(xué)雜志，1999，1（3）：139-140.

[18] Stolz E，Kaps M，Dorndorf W.Assessment of intracranial venous hemodynamics in normal individuals and patients with cerebral venous thrombosis[J].Stroke，1999，30（12）：70-75.

[19]張京芬，劉國榮，李月春，等.TCD動態(tài)監(jiān)測靜脈竇血栓形成五例[J].腦與神經(jīng)疾病雜志，2012，20（6）：443-447.

[20]馬欣，華揚(yáng)，賈建平，等.TCD在腦靜脈系統(tǒng)血栓診斷及治療監(jiān)測中的意義[J].中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，2005，21（7）：1036-1038.

CVST Animal Models Establishment and Experimental Treatment Research/

TANG Heng-xin，CAO Zhi-kai，LYU Jian-ping.//Medical Innovation of China，2014，11（12）：016-019

Objective：To study the effects of injection of urokinase and anticoagulation in treatment of CVST with new animal models.Method：Clean level chinchilla white rabbits were divided into three groups： the group A as the control group； the group B and C were respectively by the carotid artery， SSS thrombolysis treatment group. First step with absorbable suture ligation and with vascular clamp GaBi SSS made intracranial venous sinus thrombosis （CVST） animal model， the two ways of CVST thrombolysis treatment， detection target sinus blood flow velocity， sinus brain tissue water content， hemorrheology and subsequent anticoagulant therapy to maintain. 1 month after DSA and transcranial doppler （TCD） examination.Result：The new animal model was performed with good reproducibility and stability. The brain water content， basal veins blood flow velocity of the group C were significantly lower than those of the group B and the control groupA（P＜0.05）； the hemorrheology in the group B and C were changed， but the differences were not obvious. After venous sinus blood flow recanalization rate of the Group C was better than that the group B.Conclusion：The new animal model resemble clinical CVST， thus being approriate for the the experiment research of CVST. Thrombelysis via superior sagittal sinus is better than thrombelysis via carotid artery.

Cerebral venous sinus thrombosis； Intervention thrombelysis； Brain water content； Animal models

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.12.006

2014-02-04） （本文編輯：蔡元元）

廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（20131A011031）；福建省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2010Y0043）

①廣州市南沙中心醫(yī)院 廣東 廣州 511457

②廣州市第一人民醫(yī)院

曹志愷

First-author’s address：Nansha Central Hospital of Guangzhou，Guangzhou 511457，China