趙明喜，賴芳芳，賈 坤，李華濤，李守軍

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

A型流感病毒屬于正黏病毒科的成員，是具有高度傳染性的流感病原體之一，多種動(dòng)物包括鳥類、哺乳動(dòng)物和人類都對(duì)其易感[1]。A型流感病毒感染在家畜中研究廣泛，但在伴侶動(dòng)物如犬貓中研究較少，伴侶動(dòng)物與人類和家畜接觸緊密，因此，研究A型流感病毒感染伴侶動(dòng)物具有更重要的獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)意義[2]。犬貓本不是流感病毒的易感動(dòng)物，但目前研究表明，犬貓?jiān)谧匀缓驮囼?yàn)條件下對(duì)一些亞型的流感病毒易感，H3N8亞型犬流感病毒（CIV）和H3N2亞型CIV在美國和韓國已引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。

2006年，中國廣東首次分離到禽源H3N2亞型CIV，該病毒引起犬發(fā)生咳嗽、噴嚏、膿鼻涕、低熱等癥狀[6]。2009年-2010年，浙江、江蘇、北京、遼寧等地也先后分離到H3N2亞型CIV[7-8]，CIV已在沿海地區(qū)廣泛存在，應(yīng)引起研究人員的高度重視。本文從1只疑似病犬中分離到1株H3N2亞型CIV，并對(duì)其進(jìn)行研究，以期為華南地區(qū)CI的檢測和防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源 2011年12月，從外院轉(zhuǎn)診到華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院病犬，4月齡，前夜嘔吐，嘔吐物為綠色液體，次日腹瀉物呈泥狀，腹瀉次數(shù)多，精神沉郁，食欲廢絕，體溫40℃，可視黏膜蒼白。

1.1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒和膠回收試劑盒（均購自O(shè)MEGA公司）；病毒DNA提取試劑盒（購自天根生化科技（北京）有限公司）；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTPs和Taq DNA聚合酶（均購自TaKaRa公司）。

1.2 病原分離和鑒定

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用DNAStar(Version 5.07)及Primer Premier(Version 5.0)基因分析軟件，對(duì)GenBank收錄的多個(gè)犬瘟熱病毒（CDV）、犬細(xì)小病毒(CPV)、H3N2亞型CIV的基因序列分別進(jìn)行比較，CDV和CPV各設(shè)計(jì)1對(duì)鑒定引物，CIV設(shè)計(jì)11對(duì)擴(kuò)增8個(gè)基因片段的引物，其中PA、PB1和PB2分兩段設(shè)計(jì)。引物由上海英濰捷基公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取 采集病犬鼻咽、肛門拭子和嘔吐物，加入適量生理鹽水稀釋，12 000 r/min離心10min，取上清。根據(jù)病毒DNA提取試劑盒說明書提取肛門拭子和嘔吐物上清中的DNA。將鼻咽拭子上清經(jīng)雙抗處理后接種9日齡～11日齡SPF雞胚，0.2mL/枚，無菌收集96 h后未死亡的雞胚尿囊液，應(yīng)用1%雞紅細(xì)胞進(jìn)行血凝試驗(yàn)。根據(jù)病毒RNA提取試劑盒說明書分別提取鼻咽拭子上清和有血凝活性的雞胚尿囊液中的病毒全基因組。

1.2.3 病原的PCR鑒定 首先，將提取的肛門拭子和嘔吐物上清中的DNA，用CPV特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其次，將提取的鼻咽拭子上清和雞胚尿囊液中的病毒基因組RNA，分別用CDV，CIV特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增的條件如下：94℃5min；94℃30 s，53℃30 s，72℃60 s，33個(gè)循環(huán)；72℃10min。用1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增效果。

1.2.4 血凝（HA）試驗(yàn)及血凝抑制(HI)試驗(yàn) 將收集的雞胚尿囊液參照國標(biāo)方法(國標(biāo)號(hào)：GB/T 14926.53-2001)進(jìn)行HA試驗(yàn)，將具有血凝活性的雞胚尿囊液作為被檢抗原，應(yīng)用H1、H3、H5、H7、H9亞型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清，參照國標(biāo)方法(國標(biāo)號(hào)：GB/T 14926.54-2001)進(jìn)行HI試驗(yàn)。

1.2.5 分子序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 用膠回收試劑盒分別回收HA和NA基因PCR產(chǎn)物，然后將回收產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞內(nèi)，篩選陽性克隆后送往上海英濰捷基公司測序。將測序的結(jié)果用BLAST(http：//blast.nc?bi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行同源性檢索，用clustalx 2.0進(jìn)行多序列比對(duì)，用Mega 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 病毒的PCR鑒定 用CDV和CPV的特異性引物分別進(jìn)行PCR，均未擴(kuò)增出目的條帶。但用CIV M基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR，可見1 000 bp大小的特異性條帶，與預(yù)期（1 027 bp）相符（圖1）。

2.2 HA試驗(yàn)及HI試驗(yàn) 收集的雞胚尿囊液對(duì)1%雞紅細(xì)胞的HA效價(jià)為26，該血凝性能被H3亞型流感病毒陽性血清中和，與H1、H5、H7、H9亞型陽性血清和陰性血清無交叉反應(yīng)。因此，鑒定此分離株為H3亞型CIV，命名為A/canine/Guangdong/01/2011，簡稱為CGD2011。

2.3 全基因組擴(kuò)增 根據(jù)設(shè)計(jì)的H3N2亞型CIV的11對(duì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測，可見預(yù)期大小條帶（圖2）。

2.4 分子序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖1 分離株的RT-PCR檢測

圖2 分離株各基因的RT-PCR擴(kuò)增

2.4.1 HA基因序列分析 將擴(kuò)增得到的HA基因序列與國內(nèi)外登錄的16株A型流感病毒株的HA基因序列進(jìn)行比較，參考基因序列登錄號(hào)分別為：JX101433.1、JF714153.1、JX101353.1、JN247579.1、JX163256.1、GU433345.1、JN087096.1、JN087112.1、AJ427297.1、AB537451.1、AB450457.1、EU301210.1、GU473367.1、DQ124196.1、CY067382.1。擴(kuò)增得到的HA基因片段與禽源H3N2亞型CIV HA基因的核苷酸同源性最高，達(dá)到98.4%～99.1%，與H3亞型禽流感病毒HA基因的同源性為90.6%～97.1%，與馬源H3N8亞型CIV HA基因的同源性為74.0%～74.2%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，本次分離的CIV HA基因與2006年-2010年廣東、江蘇、浙江、北京、遼寧分離到的H3N2亞型CIV屬于同一分支，與H3亞型禽流感病毒的親緣關(guān)系也較近，與馬源H3N8亞型CIV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖3）。因此，可鑒定分離到的此株CIV屬于禽源H3亞型。

圖3 H3N2亞型CIV HA基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4.2 NA基因序列分析 將擴(kuò)增得到的NA基因序列與國內(nèi)外登錄的14株A型流感病毒株的NA基因序列進(jìn)行比較，參考基因序列登錄號(hào)分別為：JN247581.1、JX101371.1、JX101435.1、JF714155.1、JX163258.1、GU433347.1、AY862641.1、EU301274.1、AF156395.1、CY109428.1、AB302790.1、HQ993101.1、CY067344.1、DQ124159.1。擴(kuò)增得到的NA基因片段與禽源H3N2亞型CIV NA基因的核苷酸同源性最高，達(dá)到98.3%～99.3%，與N2亞型禽流感病毒NA基因的同源性為92.6%～94.7%，與馬源H3N8亞型CIV NA基因的同源性為27.4%～28.8%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，本次分離的CIV NA基因與2006年-2010年廣東、江蘇、浙江、北京、遼寧分離到的H3N2亞型CIV屬于同一分支，與N2亞型禽流感病毒的親緣關(guān)系也較近，與馬源H3N8亞型CIV的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（見圖4）。因此，可鑒定分離到的此株CIV屬于禽源N2亞型。

圖4 H3N2亞型CIVNA基因核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

CIV感染引起犬發(fā)生嚴(yán)重的急性呼吸道系統(tǒng)癥狀，患犬出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、噴嚏、肺炎、肌炎，心臟功能障礙、中樞神經(jīng)綜合征等癥狀[9]。發(fā)熱是流感病毒感染最顯著的臨床特征，據(jù)推測，致熱細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素、干擾素等是引起發(fā)熱的原因[10]。本試驗(yàn)病犬表現(xiàn)出發(fā)熱和消化系統(tǒng)癥狀，與典型的流感病毒感染癥狀不同，推測其原因?yàn)榱鞲胁《靖腥疽鸩∪l(fā)熱，病毒感染導(dǎo)致機(jī)體抵抗力下降，誘發(fā)幼犬出現(xiàn)胃腸炎。治療過程以抗病毒，消炎補(bǔ)液，糾正酸堿平衡和離子平衡，補(bǔ)充能量為主，經(jīng)過5 d治療，病犬轉(zhuǎn)歸，康復(fù)出院。本病例易誤診為單純胃腸炎，不進(jìn)行抗病毒治療，后期易發(fā)展成呼吸道系統(tǒng)癥狀，多數(shù)H3N2亞型CIV感染死亡病例皆因其發(fā)展成呼吸系統(tǒng)疾病而致[11]。

流感病毒感染期間，病毒通過鼻咽分泌物，噴嚏和咳嗽傳播，病毒的排毒持續(xù)時(shí)間和排毒數(shù)量是決定其傳染性的重要因素[12]。CI的治療策略既要減輕其臨床癥狀，同時(shí)要減弱其傳染性。與未出現(xiàn)發(fā)熱癥狀的流感病毒感染病例相比，出現(xiàn)發(fā)熱的病例會(huì)出現(xiàn)更高量的鼻腔排毒，較高水平的病毒排毒量反應(yīng)了疾病的嚴(yán)重性，或是減弱了宿主的防御機(jī)制，需立即引起注意和治療[10]。因此，臨床上若遇到發(fā)熱的疑似病例，應(yīng)立即進(jìn)行隔離治療，減弱其傳染性。

流感病毒尤其是H5N1亞型高致病禽流感病毒的種間傳播，是對(duì)人類健康的潛在威脅[13]。禽源H3N2亞型流感病毒感染犬，致使犬發(fā)生急性呼吸道系統(tǒng)疾病，并在犬中進(jìn)行水平傳播[4]。這說明禽流感病毒能突破種間屏障（禽到哺乳動(dòng)物）進(jìn)行傳播，也存在從禽類傳播給人類的可能[14]。流感病毒能在家養(yǎng)肉食動(dòng)物中傳播，研究人員推測這些哺乳動(dòng)物作為流感病毒的載體，在流感病毒的傳播過程中可能占有重要角色[15]。因而需要系統(tǒng)監(jiān)測H3N2亞型CIV的發(fā)病情況和病毒演化，為CI的防控提供依據(jù)。

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