鄒 麗，周 雪，徐登峰

（1.重慶市巴南區(qū)南彭街道畜牧獸醫(yī)站，重慶 巴南401347；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌402460)

豬傳染性胸膜肺炎（porcinecontagious pleuro?pneumonia，PCP）的病原是傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus Pleuropneumonia，APP），由Patti?son在1957年首先發(fā)現(xiàn)，1964年Shope等和White等命名[1]。傳染性胸膜肺炎是一種威脅全國養(yǎng)豬業(yè)的呼吸道細菌性疾病，臨床上可以相對控制該病，但是在拉丁美洲和歐洲國家仍是一個棘手的問題。國內(nèi)大多數(shù)省市經(jīng)臨床學(xué)、病原學(xué)、血清學(xué)診斷和檢疫，均發(fā)現(xiàn)有該病發(fā)生，說明PCP在我國已廣泛流行，并有擴大蔓延之勢[2-4]。傳染性胸膜肺炎除了引起感染豬只死亡外，還可變?yōu)槁约膊。股a(chǎn)能力下降，導(dǎo)致醫(yī)藥和疫苗的費用不斷增加，造成養(yǎng)殖戶嚴重的經(jīng)濟損失。本試驗對重慶市巴南區(qū)豬場發(fā)生的豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染進行初步研究，分離鑒定豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5株，獲得其對抗生素的敏感性結(jié)果，為該病的防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 2011年5月─2012年12月，從重慶市巴南區(qū)疑似傳染性胸膜肺炎的豬場采集病料86份，其中肺臟49份、關(guān)節(jié)液24份、脾臟9份和淋巴結(jié)4份。所有病死豬臨床癥狀均表現(xiàn)為：高熱、咳嗽、口腔和鼻腔血樣分泌物，皮膚發(fā)紺，呼吸衰竭。

1.2 主要試劑 普通營養(yǎng)瓊脂、純化瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂平板，購自杭州天和微生物試劑有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自AMRESCO公司；生化微量鑒定管、藥敏紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司；瓊脂粉，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；標準金黃色葡萄球菌菌株（ATCC 25923），購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.3 分離純化 病料無菌接種含NAD的鮮血瓊脂平板，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落形態(tài)。挑取2mm～3mm大小、無色透明、露珠樣并有溶血現(xiàn)象的菌落繼續(xù)培養(yǎng)分純。

1.4 鏡檢及培養(yǎng)特性觀察 將分離到的疑似APP用革蘭染色法染色鏡檢。并將純化細菌分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱平板、伊紅美藍瓊脂平板、鮮血平板、巧克力平板、含NAD的鮮血平板和含NAD的巧克力平板，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察菌落形態(tài)。

1.5 衛(wèi)星試驗 將純培養(yǎng)疑似菌株接種普通營養(yǎng)瓊脂平板，垂直劃線接種金黃色葡萄球菌，同時以不接種金黃色葡萄球菌的平板做對照，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)箱，24 h～48 h后觀察細菌生長情況。

1.6 生化鑒定 將分離到的純培養(yǎng)細菌分別接種于葡萄糖、木糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、β-半乳糖苷、M.R.、V-P、硝酸鹽還原、脲酶、過氧化氫酶生化鑒定管，同時各管加入5μL 1%NAD，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)箱，16 h～24 h內(nèi)觀察發(fā)酵結(jié)果。

1.7 藥敏試驗 鑒定為陽性的菌株接種于含NAD的瓊脂平板，均勻涂布晾干后選取氨芐青霉素、鏈霉素、青霉素、四環(huán)素、多粘菌素B、磺胺甲基異噁唑、氟哌酸、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟、先鋒霉素Ⅴ、丁胺卡那霉素、慶大霉素、強力霉素、萬古霉素14種抗生素藥敏紙片貼于平板上，置于5%CO237℃培養(yǎng)箱，24 h后觀察并測量抑菌圈直徑。判定標準參考杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏實驗紙片法的抑菌范圍解釋標準》中嗜血桿菌和其他革蘭陰性桿菌的藥敏紙片抑菌標準。藥敏紙片保存于-20℃冰箱。

1.8 動物回歸試驗 健康家兔8只隨機分為2組，試驗組皮下注射APP菌液0.2mL/只，對照組皮下注射生理鹽水0.2mL/只，隔離飼養(yǎng)，觀察家兔發(fā)病和致死情況，從病死家兔體內(nèi)分離細菌鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病原菌分離培養(yǎng)及鏡檢 24 h～48 h后在含NAD的鮮血瓊脂平板長出1mm～2mm表明光滑、半透明、露珠樣小菌落，經(jīng)革蘭染色后，疑似菌株為革蘭陰性短小桿菌，無芽孢，偶見球桿狀和長絲狀，呈散在分布。在普通營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱培養(yǎng)基平板、伊紅美藍瓊脂平板和鮮血平板不生長，在巧克力培養(yǎng)基上有散在的菌落出現(xiàn)，在含NAD的鮮血平板生長良好，菌落針尖大小，出現(xiàn)β溶血。在含NAD的巧克力平板菌落較含NAD的鮮血平板大，呈光滑、灰白色菌落，但不宜觀察到溶血環(huán)。

2.2 衛(wèi)星試驗 越靠近金黃色葡萄球菌的菌落生長越好，菌落大、數(shù)量多，離得越遠菌落小而數(shù)量少，直至不生長，表明該病原菌生長依賴V因子。

2.3 生化鑒定 該病原菌能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、木糖、β-半乳糖苷，乳糖、M.R.、V-P，試驗為陰性，脲酶、過氧化氫酶試驗均為陽性。甘露醇和硝酸鹽還原試驗呈現(xiàn)輕微的不穩(wěn)定性。

2.4 藥敏試驗結(jié)果 藥敏試驗結(jié)果顯示該病原菌對氟哌酸、頭孢噻肟、先鋒霉素Ⅴ、強力霉素高度敏感；對磺胺甲基異噁唑、環(huán)丙沙星、丁胺卡那霉素中度敏感；對氨芐青霉素、鏈霉素、青霉素、四環(huán)素、多粘菌素B、慶大霉素、萬古霉素耐藥。不同豬場分離到的APP對抗生素的敏感性存在差異，如BN1和BN3對環(huán)丙沙星表現(xiàn)為高度敏感；而其余表現(xiàn)為中度敏感。

表1 5株分離病原菌藥敏試驗 （mm）

2.5 動物回歸試驗結(jié)果 試驗組家兔在接種APP菌液后8 h～10 h出現(xiàn)精神沉郁，呼吸急促，食欲減退，4只家兔在24 h～48 h內(nèi)全部死亡。剖檢發(fā)現(xiàn)病死家兔氣管和支氣管中血性黏液，肺部有纖維素性物質(zhì)滲出。經(jīng)分離鑒定，顯示該致病菌為APP。對照組家兔體溫、飲水和食欲正常。

3 討論

傳染性胸膜肺炎放線桿菌病發(fā)病初期，大多數(shù)豬場首先會選用抗生素治療，但抗生素治療對該病臨床診斷和治療增加了不小的難度。由于APP生長依賴V因子的存在，此特性給APP的實驗室病原菌診斷方向選擇時增加了困難。此外，采樣不合理、樣品污染等也是造成不宜成功APP分離的原因?；谝陨显?，本研究采集臨床和剖檢癥狀疑似傳染性胸膜肺炎放線桿菌病的死亡豬病料89份，而實際只分離到5株APP。

“衛(wèi)星試驗”證明了APP的生長需要V因子的存在，在含有NAD巧克力平板生長好于含有NAD的鮮血平板，表現(xiàn)為菌落更大，顏色更深，推測可能是紅細胞變性時釋放出一定量的V因子，增加了培養(yǎng)基V因子濃度，時APP生長更為旺盛。在含有NAD的鮮血平板上，APP周圍出現(xiàn)β溶血，因為溶血素是APP最主要的獨立因子之一，具有強溶血活性和細胞毒性。

抗生素大量用于治療細菌性疾病，導(dǎo)致APP存在廣泛的耐藥性。本研究結(jié)果顯示，分離到的5株APP對頭孢和喹諾酮類抗生素高度敏感；而對四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素耐藥。隋慧[5]調(diào)查了錦州豬傳染性傳染性胸膜肺炎的流行情況，發(fā)現(xiàn)從該地區(qū)分離得到的APP對四環(huán)素類和氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為中度敏感。長期不合理的使用抗生素，導(dǎo)致APP對抗生素敏感性降低，耐藥普增大；再者地區(qū)的差異也致使APP對抗生素的敏感性有所不同。本研究對重慶市巴南區(qū)APP藥物敏感性的分析，獲得各個規(guī)模場的耐藥譜，對臨床上治療該病具有指導(dǎo)性意義。

[1]Barbara E.Straw，Jeffery J，Sylvie D′Allaire，等.豬病學(xué)，趙德明，張仲秋，沈建忠，譯[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：633.

[2]Tobias T J，Raymaker R J，van Nes A，etal.Outbreak of respira?tory distress resembling influenza caused by Actinobacillus pleuro?pneumoniae pigs[J].VetRec，2009，164(13)：402-403.

[3]杜宗沛，解慧梅，吳植，等．豬放線桿菌性傳染性胸膜肺炎的診治與預(yù)防[J].中國獸醫(yī)雜志，2010，46（11）：78-79.

[4]余燕，馬金友，王天有，等.豬接觸傳染性傳染性胸膜肺炎的診治[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，8：107-112．

[5] 隋慧.錦州地區(qū)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離與鑒定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（6）：3366-3367．