呼顯生，付連軍，陳國良，唐寶智，劉麗敏

（1.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動醫(yī)學(xué)院，吉林 吉林132101；2.吉林省東遼縣動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 東遼136600；3.吉林省撫松縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站，吉林 撫松134500；4.吉林省撫松縣興參鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)科技站，吉林 撫松134523）

本試驗(yàn)對來自吉林地區(qū)發(fā)生仔豬水腫病豬場的典型發(fā)病仔豬，在無菌條件下采集仔豬的小腸黏膜刮取物及相應(yīng)腸段、腸系膜淋巴結(jié)。然后進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)、形態(tài)與染色、生化特性等鑒定試驗(yàn)，并進(jìn)行血清型鑒定及毒力測定試驗(yàn)。

1 材料

1.1 病料 吉林地區(qū)不同的豬場中發(fā)病仔豬典型死亡病例21頭，實(shí)驗(yàn)室解剖檢，在無菌條件下采集仔豬的小腸黏膜刮取物及相應(yīng)腸段、腸系膜淋結(jié)。

1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯、血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面等，均按常規(guī)方法配制。

1.3 微量發(fā)酵管 由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 主要儀器 奧林帕斯顯微鏡（日本制造）、電子恒溫水浴鍋（天津泰斯特電子有限公司制造）、振蕩培養(yǎng)箱等。

1.5 大腸桿菌O因子血清（O1-O163），均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.6 實(shí)驗(yàn)動物 昆明系小鼠體重16 g～18 g，購自長春生物制品研究所。斷奶仔豬由各地區(qū)種畜場提供，共計(jì)30頭仔豬，日齡40～45日齡，臨床健康，無注射仔豬水腫病疫苗史的仔豬。

2方法

2.1 病原菌分離及純粹性檢驗(yàn)

2.1.1 病原菌分離 在無菌條件下采集仔豬的小腸黏膜刮取物及相應(yīng)腸段腸系膜淋巴結(jié)，分別接種血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。挑取在麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基上呈紅色菌落和在血瓊脂平板培養(yǎng)基呈溶血的典型菌落，分別轉(zhuǎn)接于三糖鐵培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基，做初步純培養(yǎng)及生化鑒定。將在三糖鐵培養(yǎng)基反應(yīng)模式符合埃希氏菌屬菌株進(jìn)行編號備用。

2.1.2 純粹性檢驗(yàn) 將編號菌株分別接種于適量營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)18 h～24 h。取液體培養(yǎng)物劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，挑取各菌株典型單個菌落用營養(yǎng)肉湯適當(dāng)稀釋，分別均勻涂布于血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基。每個菌株接種兩板，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察結(jié)果。另取一個相同菌落接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基作為種子菌株，用適量生理鹽水洗下，分離到離心管中，加入50%甘油放置于-70℃低溫冰柜中保存。

2.2 病原菌形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察 將接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基作為種子菌株，分別接種適量營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，并劃線接種血瓊脂平板培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂平板培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18 h～24 h，觀察病原菌培養(yǎng)特性，并分別進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察結(jié)果。

2.3 病原菌生化特性鑒定

2.3.1 糖發(fā)酵試驗(yàn) 取各菌株純培養(yǎng)物，分別接種葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、蔗糖等微量發(fā)酵管中，各兩支，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，觀察并記錄結(jié)果。2.3.2 M.R.／VP試驗(yàn) 取各菌株純培養(yǎng)物，分別接種葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基兩支微量發(fā)酵管中，37℃培養(yǎng)48 h，一支滴加M.R.指示劑5～6滴，立即觀察；另一支按每2mL滴加0.2mL歐-波二氏試劑，輕搖試管，觀察并記錄結(jié)果。

2.4 血清型鑒定

2.4.1 玻片凝集抗原的制備取純培養(yǎng)物 分別接種10mL營養(yǎng)肉湯，37℃培養(yǎng)20 h～24 h，劃線接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20 h～24 h，用適量無菌生理鹽水制成濃菌液，經(jīng)121℃高溫處理2 h，冷卻后備用。

2.4.2 血清型鑒定 分別將血清用滅菌生理鹽水作5×、10×稀釋備用。取0.01mL抗O單因子血清滴加到玻片上，在對應(yīng)玻片滴加0.01mL供試菌株抗原，混勻后靜置。以O(shè)1-O163菌株作陽性對照，以生理鹽水作陰性對照，觀察結(jié)果。

2.5 病原性鑒定

2.5.1 菌液制備 將菌株分別接種20mL營養(yǎng)肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h～24 h，測定菌數(shù)。并將各地區(qū)菌株按一定比例配成混合菌液。

2.5.2 菌株致病性鑒定 將通過上述方法制備的菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后（分別取原液0.05、0.1、0.2 mL，用生理鹽水稀釋到0.2mL），0.2mL／只，腹腔注射小鼠，每組5只，記錄發(fā)病和死亡情況。將菌液進(jìn)行適當(dāng)稀釋后（分別取原液0.1、0.2、0.4、0.6mL，用生理鹽水稀釋到1mL），1mL／頭，肌肉注射斷奶仔豬，每組3頭，記錄發(fā)病和死亡情況。

3結(jié)果

3.1 病原菌分離結(jié)果 從吉林地區(qū)不同豬場典型發(fā)病仔豬死亡21頭病料中，分離出病原菌8株。

3.2 純粹性檢驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)后，觀察，在營養(yǎng)瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、血瓊脂平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌落均為整齊的單一菌落。

3.3 病原菌形態(tài)及培養(yǎng)特性觀察結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)后，觀察，在營養(yǎng)瓊脂平板菌落形態(tài)為中等大小菌落，呈半透明灰白色；麥康凱瓊脂平板為紅色中等大小菌落；血瓊脂平板明顯溶血；營養(yǎng)肉湯均勻渾濁，管底有沉淀。染色特性為革蘭陰性中等大小桿菌。

3.4 菌株生化特性結(jié)果 見表1。

表1 菌株生化特性

3.5 菌株血清型鑒定結(jié)果 用O139陽性菌株作陽性對照，生理鹽水作陰性對照成立條件下，各菌株血清型，結(jié)果見表2。表2菌株血清型鑒定結(jié)果見表2。

表2菌株血清型鑒定

3.6 菌數(shù)測定結(jié)果 將分離到的不同菌株接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果見表3。

表3 細(xì)菌計(jì)數(shù)

表4 毒力測定

3.7 毒力測定結(jié)果 對小鼠毒力測定結(jié)果見表4，主要臨床癥狀均為后肢癱瘓，運(yùn)動失調(diào)。對斷奶仔豬致病性結(jié)果見表5。其他各菌株均采用相同方法測定，均使40日齡仔豬死亡，表明仔豬對菌液中菌體和毒素敏感。本試驗(yàn)接種途徑采用肌肉注射方式。

表5 雙吉株混合菌液致病性

4 小結(jié)

4.1 病原菌鑒定 分別從雙吉、口前、二道、土城子等吉林部分地區(qū)不同發(fā)病豬場采集21份病料中，經(jīng)細(xì)菌的分離鑒定、形態(tài)與染色、培養(yǎng)特性、生化特性、致病性、血清性試驗(yàn)，符合仔豬水腫病病原菌特性的菌株有8株，它們分別是雙吉1號菌株（O139），雙吉2號菌株（O141），口前1號菌株（O141），二道1號菌株（O138），二道2號菌株（O139、O2）（注：由同一豬場分離二株病原菌），土城子1號菌株（O141），河灣子1號菌株（O139），河灣子2號菌株（O8）。

4.2 菌株最小致死量（MLD）確定 對小鼠雙吉1號菌株、4億，雙吉2號菌株、2.5億，混合菌液、2.5億；口前1號菌株、3億；二道1號菌株、3.6億，二道2號菌株（1）、3億，二道2號菌株（2）、4億；混合菌液、3.6億；土城子1號菌株、3.6億；河灣子1號菌株、4億，河灣子2號菌株、3億；混合菌液、2.5億；O139菌株、4億。對仔豬雙吉混合菌液菌株和其他菌株均為8億。

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