郝華芳，張淑霞，楊 濤，楊增岐，王興龍，杜恩岐，黨如意，王晶鈺

（西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌712100）

禽腦脊髓炎（AE）是由禽腦脊髓炎病毒（Avain Encephalomyelitis Virus，AEV）引起的一種主要侵害幼齡雞的病毒性傳染病。以共濟(jì)失調(diào)、頭頸部快速震顫、衰竭死亡、產(chǎn)蛋下降為特征。本病1930年最早發(fā)現(xiàn)于美國，我國于1980年首次被張澤紀(jì)報(bào)道，隨后在我國迅速傳開[1]。陜西省自1997年報(bào)道AE以來，近年來疫情有上升的趨勢(shì)[2]。2012年1月，陜西楊凌某種雞場(chǎng)，種雞產(chǎn)蛋量突然下降約26%，種蛋孵化率降低20%左右，死雛、弱雛明顯增多，剖檢可見腺胃壁表面有少量灰白色病灶，腦組織有輕微水腫、充血，初步懷疑為禽腦脊髓炎，通過采集病料、接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離與鑒定，結(jié)果分離到1株AEV陜西地方流行毒株，并對(duì)該分離株的VP1基因進(jìn)行了序列分析，試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 抗原及血清 標(biāo)準(zhǔn)AE瓊擴(kuò)抗原、AE陽性血清、SPF雞血清由西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院禽病研究室提供。

1.2 SPF雞胚 1日齡非免疫雞、6日齡SPF雞胚，購自楊凌綠方生物工程公司。

1.3 分子生物學(xué)試劑 RNAiaso Plus、pMD18-T Simple載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL-2 000、PCR Taq酶、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和SalⅠ，購自寶生物工程（大連）有限公司；高純度質(zhì)粒提取試劑盒，購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司；膠回收試劑盒，購自西安潤(rùn)德有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 病毒分離鑒定 無菌采集病雞的大腦和十二指腸，研磨凍融后，4 000 r/min離心5min，取上清加雙抗10 000 IU（μg）/mL，4℃作用6 h后接種6日齡SPF雞胚的卵黃囊，0.2mL/枚，置37℃溫箱培養(yǎng)，每天照蛋觀察，棄去24 h內(nèi)的死胚。12 d后，無菌收集有典型病變雞胚的腦、胰腺、胃腸道以及尿囊液；用所收集尿囊液作為稀釋液處理病料，研磨、凍融后即為第1代病料樣品（F1）和傳代材料，盲傳3代后同上收集病料。將收集的樣品用瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)（AGP）檢測(cè)。

1.5 人工感染試驗(yàn) 將1日齡非免疫雞隨機(jī)分為2組，每組10只。第1組為試驗(yàn)組，每只雛雞腦內(nèi)接種瓊擴(kuò)試驗(yàn)呈陽性的病毒液0.05mL；第2組為對(duì)照組，每只雛雞腦內(nèi)接種0.05mL生理鹽水。隔離飼養(yǎng)、觀察，并記錄發(fā)病情況和病死雞的病理變化。

1.6 AEV YL株VP1基因的克隆 按照RNAiaso Plus說明書和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行病毒RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄，置于-20℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)GenBank中AEV 1143株基因序列（登錄號(hào)：AJ225173.1）設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上、下游引物分別引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)（下劃線部分），上游引物P1：5′-GAATTCATGGGGAAAGAGGATGAAGGA-3′；下游引物P2：5′-ACGCGTCGACCTACTCTTCTACCAACT C-3′。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆至pMD18-T Simple載體，進(jìn)行測(cè)序。

1.7 AEV VP1基因的序列分析 用DNAStar生物軟件對(duì)AEV YL株VP1基因序列進(jìn)行分析，并與已知的AEV VP1序列進(jìn)行比較。AEV VP1基因的參考毒株有1143株、VR株、L2Z株、SX株、HB株、SD株和NH937株，其中1143株、VR株和L2Z株Gen?Bank的登錄號(hào)分別為AJ225173.1、AY466473.1、AY275539.1和JN986828.1，HB株[3]、SD株[3]和NH937株[4]沒有登錄號(hào)，序列來自文獻(xiàn)[3-4]。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離與鑒定 將病料接種6日齡SPF雞胚，連續(xù)傳至第3代時(shí)，收集處理的病毒樣品做瓊擴(kuò)試驗(yàn)?？煽吹?個(gè)（1個(gè)F1、3個(gè)F3）分離樣品與標(biāo)準(zhǔn)AE陽性血清之間出現(xiàn)特異性沉淀線，而與SPF雞血清之間沒有沉淀線，表明該分離株為禽腦脊髓炎病毒，命名為AEV YL株。

2.2 人工感染試驗(yàn) 試驗(yàn)組雛雞在接種后7 d，5只開始出現(xiàn)臨床癥狀，繼續(xù)觀察至10 d，又有3只發(fā)病，共計(jì)發(fā)病8只，5只很快死亡，臨床表現(xiàn)精神委頓、易受外界驚嚇、震顫、站立不穩(wěn)、共濟(jì)失調(diào)等癥狀；剖檢病死雞可見內(nèi)臟器官無明顯病變，大腦有輕微的水腫和軟化，大腦與腦殼粘連。采集病料進(jìn)行AGP檢測(cè)，發(fā)病雞腦組織均為AE陽性。對(duì)照組雛雞未見發(fā)病。

2.3 VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增 從分離到的病毒材料中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后經(jīng)PCR擴(kuò)增得到AEV YL株的VP1基因，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在810 bp處有特異性條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 VP1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4 陽性克隆的鑒定 PCR產(chǎn)物純化后克隆至pMD18-T載體，提取重組質(zhì)粒（pMD18-T-VP1），用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果在2 692 bp和810 bp處有特異性條帶(圖2)，與預(yù)期相符。以上結(jié)果表明，AEV YL株VP1基因已經(jīng)正確插入到pMD18-T載體中。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18-T-VP1酶切鑒定

2.5 AEV YL株VP1基因的序列測(cè)定 測(cè)序結(jié)果顯示，AEV YL株VP1基因全長(zhǎng)為810 bp，編碼270個(gè)氨基酸殘基。利用Prot Param對(duì)YL VP1蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，VP1蛋白的分子質(zhì)量為30.45 ku，理論等電點(diǎn)（p I）為5.12，原子個(gè)數(shù)總計(jì)8 535個(gè)，分子式為C2446H4084N810O1024S171。

2.6 AEV YL株VP1基因的同源性分析 應(yīng)用Blast、DNAStar生物軟件，將測(cè)得的AEV YL株的VP1序列與SX株、1143株、VR株、L2Z株、HB株、SD株和NH937株的VP1基因序列比較，發(fā)現(xiàn)沒有插入和缺失。表1的結(jié)果表明，YL株與參考毒株的VP1基因同源性為92.0%～99.8%，推導(dǎo)的氨基酸同源性為89.3%～99.3%。YL株與SX株相比有7個(gè)堿基發(fā)生改變，同源性為99.1%；與1143株、L2Z株同源性最高，只有2個(gè)堿基不同，同源性為99.8%；與內(nèi)蒙古分離株同源性最低，僅有92.0%。

表1 不同毒株AEV VP1基因核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的同源性

2.7 AEV VP1基因進(jìn)化分析 根據(jù)AEV VP1基因的核苷酸差異性，將YL株與已知的AEV毒株建立遺傳進(jìn)化樹（圖3）。進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，YL株與1143株、L2Z株處于1個(gè)分支，親緣關(guān)系較近；與陜西分離株SX處于1個(gè)大的分支，親緣關(guān)系也較近；與VR株、HB株、SD株和NH937株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 AEV VP1基因（核苷酸）系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 討論

本次發(fā)病種雞的品種為尼克紅，在241日齡時(shí)出現(xiàn)產(chǎn)蛋量突然下降26%左右，持續(xù)10 d后逐漸恢復(fù)。產(chǎn)蛋下降期間所產(chǎn)種蛋的孵化率明顯降低，死雛、弱雛明顯增多，病雛精神沉郁，不愿走動(dòng)，共濟(jì)失調(diào)，頭頸部快速震顫，最后衰竭死亡。對(duì)死雛進(jìn)行剖檢，在腺胃壁表面可見少量灰白色區(qū)域，腦組織有輕微水腫、充血，其他臟器無明顯病變[5-6]，初步懷疑為禽腦脊髓炎。采集病雛腦組織和十二指腸，研磨處理后接種SPF雞胚進(jìn)行病毒分離，盲傳3代收集病毒樣品進(jìn)行AGP檢測(cè)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，陽性血清與空白對(duì)照之間未出現(xiàn)沉淀線，而與標(biāo)準(zhǔn)抗原和1個(gè)（F1代）、3個(gè)（F2代）樣品之間出現(xiàn)了沉淀線，因此可以初步確定，陽性血清與待測(cè)樣品之間的沉淀線為AEV抗原抗體特異性沉淀線，即所分離到的病料中含有禽腦脊髓炎病毒。

在人工感染試驗(yàn)中，接種的10只1日齡雛雞中有8只發(fā)病，病雞表現(xiàn)出較為典型的AE癥狀，即體質(zhì)較弱，見有震顫、站立不穩(wěn)、行走困難、共濟(jì)失調(diào)等，死亡后剖檢，臟器無明顯的病理變化，僅大腦略有異常，有輕微的水腫和軟化，與腦殼粘連，這些特征與吳志強(qiáng)[7]，周鐵忠[8]等描述的禽腦脊髓炎病毒感染雛雞的情況部分類似。采集試驗(yàn)組病死雞病料進(jìn)行AGP檢測(cè)，發(fā)病雞腦組織均為AE陽性，對(duì)照組雛雞未見發(fā)病。人工感染試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步表明，分離到的病料中含有禽腦脊髓炎病毒。此外，吳志強(qiáng)等[7]發(fā)現(xiàn)患病雛雞被驅(qū)趕時(shí)，行走不能控制，以跗關(guān)節(jié)和脛關(guān)節(jié)著地，后期兩肢麻痹、癱瘓，本試驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)；周鐵忠[8]在AEV感染的病雛中發(fā)現(xiàn)部分雞一側(cè)眼瞼麻痹，眼睛半閉或全閉，該側(cè)眼分泌物增多，晶狀體逐漸渾濁褪色，在本試驗(yàn)中也沒有看到?？赡苁怯捎谶@些病變并非具有典型性和特異性，不是在發(fā)病的每個(gè)雛雞身上都有表現(xiàn)。

本試驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的AEV 1143株的序列，設(shè)計(jì)特異性引物，利用RT-PCR方法對(duì)AEV陜西分離株的VP1基因擴(kuò)增并測(cè)序，結(jié)果上傳到Gen?Bank，登錄號(hào)為：JQ894852。測(cè)序結(jié)果顯示，AEV YL分離株VP1基因全長(zhǎng)為810 bp，編碼270個(gè)氨基酸，分子量大小約為30.45 Ku。應(yīng)用DNAStar分析軟件對(duì)AEV YL分離株VP1基因的核苷酸序列與GenBank中已登錄的毒株比較發(fā)現(xiàn)，YL株與1143株等毒株的VP1基因核苷酸序列同源性為92.0%～99.8%，氨基酸序列同源性為89.3%～99.3%；AEV YL株與SX株的同源性為99.1%，有7個(gè)堿基發(fā)生改變，其編碼的氨基酸序列有5個(gè)氨基酸殘基發(fā)生改變。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，YL株與1143株、L2Z株處于一個(gè)分支，親緣關(guān)系較近；與陜西分離株SX處于一個(gè)大的分支，親緣關(guān)系也較近；與VR株、HB株、SD株和NH937株處于不同的分支，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。經(jīng)分析表明，AEV不同毒株VP1基因存在一定程度的差異，并不是高度保守的，與韋莉等[9]的研究結(jié)果有所不同。本試驗(yàn)為AEV的基因序列補(bǔ)充了新的數(shù)據(jù)，為陜西禽腦脊髓炎的診斷與預(yù)防提供了理論依據(jù)。

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