宋靚婧，馬小媛，段 諾，吳世嘉，王周平

基于Au/SiO2信號放大的沙門氏菌檢測方法

宋靚婧，馬小媛，段 諾，吳世嘉，王周平*

（食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

目的：基于Au/SiO2信號放大，通過循環(huán)伏安法實現(xiàn)對沙門氏菌（Salmonella）的高靈敏度檢測。方法：將與沙門氏菌靶基因DNA互補配對的堿基序列（捕捉DNA和顯示DNA），分別修飾于導(dǎo)電玻璃電極（indium tin oxide，ITO）及Au/SiO2納米顆粒表面，構(gòu)建捕獲探針和顯示探針，當在體系中加入沙門氏菌靶DNA后，會形成捕捉DNA-靶DNA-顯示DNA構(gòu)成的“三明治夾心”結(jié)構(gòu)。由于Au/SiO2的含量與靶DNA濃度呈正相關(guān)，因此靶DNA濃度的變化可導(dǎo)致ITO峰電流值相應(yīng)變化，從而達到檢測目的。結(jié)果：在最優(yōu)實驗條件下，檢測沙門氏菌靶DNA時，濃度在10-11～10-7mol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.000 3x+0.000 1（R2=0.998 9），最低檢測限為6 pmol/L；檢測沙門氏菌時，線性范圍為50～7 910 CFU/mL，線性回歸方程為y=-1.6×10-7x+0.003 2（R2=0.994 0），最低檢測限為35 CFU/mL。結(jié)論：經(jīng)特異性及實驗加標回收實驗證明本方法可用于實際樣品的檢測。

食品分析；沙門氏菌；納米金；二氧化硅；循環(huán)伏安法

沙門氏菌（Salmonella）是兼性厭氧革蘭氏陰性菌，在環(huán)境中分布廣泛[1]。由沙門氏菌引發(fā)的沙門氏菌病是世界各地最為普遍的食源性細菌疾病之一，在公共衛(wèi)生學(xué)上具有十分重要的意義[2-3]。傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法步驟繁瑣、耗時長，難以滿足當前追求快速、高效的沙門氏菌檢測需要[4]。為此，各國研究人員針對沙門氏菌的快速檢測做了大量研究，已報道的方法多種多樣，如基于免疫學(xué)的免疫磁珠分離法、熒光免疫分析法、酶聯(lián)免疫法等[5-9]及基于分子生物學(xué)的聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、多重PCR（multiplex PCR）、基因芯片法等[10-13]。這些方法雖在一定程度上節(jié)省了操作時間，但其最低檢測限一般在100 CFU/mL以上，一些步驟操作繁瑣、成本較高、出現(xiàn)假陽性等諸多不足，難以推廣利用。

納米技術(shù)作為當今的前沿科技，在許多領(lǐng)域都展現(xiàn)出宏觀材料所無可比擬的優(yōu)越性[14-15]。納米金作為納米材料中一種研究較早、發(fā)展成熟的材料在食品安全領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。納米金也稱作膠體金，其直徑大小為1～100 nm[16]。納米金制備簡單、性質(zhì)穩(wěn)定、顆粒均一，除具備一般納米材料的表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)、量子效應(yīng)等特性外，還具有良好的導(dǎo)電性，在建立高靈敏度的生物傳感器方面具有重要作用[17-19]；同時還具有良好的生物相容性，能迅速吸附生物大分子但不改變其活性[20-22]。在一定實驗條件下，構(gòu)建Au/SiO2納米復(fù)合材料，借助SiO2納米材料比表面積大、不易團聚、易修飾等特點，將其作為DNA的連接載體；借助納米金良好的導(dǎo)電性，將其作為生物分子與電極之間的導(dǎo)線，起到加快異相界面的電子傳遞速率的作用，納米復(fù)合顆粒較單一顆粒更易形成連續(xù)勢場，因此在增強電流效應(yīng)、放大電信號、提高靈敏度方面表現(xiàn)優(yōu)異[23-25]。

本實驗研究了一種基于納米金的沙門氏菌電化學(xué)檢測方法。通過在親和素化的ITO表面修飾生物素標記的捕捉DNA，在親和素化的Au/SiO2納米材料表面修飾生物素標記的顯示DNA，構(gòu)建捕捉探針及顯示探針，結(jié)合靶DNA，形成一種由捕捉DNA-靶DNA-顯示DNA構(gòu)成的“三明治夾心”結(jié)構(gòu)的DNA雜交產(chǎn)物。由于Au/SiO2的含量與靶DNA濃度呈正相關(guān)，利用ITO及納米金的導(dǎo)電性，基于電化學(xué)方法，在一定濃度范圍內(nèi)，通過循環(huán)伏安法，ITO表面的峰電流值隨著靶DNA濃度的改變而發(fā)生有規(guī)律的變化，從而實現(xiàn)對沙門氏菌高靈敏的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃氨水、無水乙醇、正硅酸四乙酯（ethylsilicate，TEOS）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、戊二醛、氯金酸、NaBH4、H2O2（均為分析純）國藥集團上?；瘜W(xué)試劑有限公司；導(dǎo)電玻璃（ITO） 廣東力新達能源材料有限公司；親和素 美國Sigma公司；Biospin細菌基因組DNA提取試劑盒 伯爾迪生物科技（杭州）有限公司；本實驗涉及菌種均取自本實驗室；所有寡核苷酸序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

沙門氏菌特異寡核苷酸探針序列[26]：

Seq1：5’- GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA -biotin - 3’（捕捉DNA）

Seq2：5’- SH-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT - 3’（顯示DNA）

Seq3：5’- TAT CGT CGG TAA GGC ACG CTC AAT TGT CGT TAA AGT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT - 3’（目標序列）

Seq4：5’- TAT CGT CGG TAA GGC AAG CTC AAT TGT CGT TAA AGT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT - 3’（目標序列-單堿基突變鏈）

Seq5：5’- TAT CGT CGG TAT GGC AAG CTC AAT TCT CGT TTA ACT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT - 3’（目標序列-五堿基突變鏈）

Seq6：5’- ACA TCT GCA AAA CCG TAT AAG TCC GGT TCG ATA ATG CTG TTG CGG CTT GCT TTT CCG CG -3’（隨機對照鏈）

1.2 儀器與設(shè)備

CHI660D電化學(xué)工作站三電極體系（ITO工作電極、銀/氯化銀參比電極、鉑絲對電極） 上海辰華儀器有限公司；JEM-2100HR透射電子顯微鏡 日本Jeol公司；UV-1800紫外分光光度計 日本島津 公司；NICOLET iS10傅里葉紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 親和素化的SiO2納米材料的制備

本實驗采用Stober等[27]方法稍加改進制備單分散二氧化硅粒子。

1）配制A液：5 mL NH3·H2O+20 mL 無水乙醇+ 10 mL超純水；B液：1.8 mL TEOS+5 mL 無水乙醇。

2）將B液逐滴加入A液中，混合液于30 ℃磁力攪拌1 100 r/min條件下反應(yīng)4～6 h。再加入APTES 0.4 mL，繼續(xù)反應(yīng)2 h。將所得產(chǎn)物于10 000 r/min離心10 min，依次用無水乙醇、PBS緩沖液（NaCl 0.8 g、KCl 0.02 g、Na2HPO4·12H2O 0.29 g、KH2PO40.024 g、H2O 100 mL、pH 7.4）離心洗滌3 次，收集沉淀。

3）加入體積分數(shù)為5%的戊二醛-PBS緩沖液50 mL，室溫磁力攪拌1 100 r/min條件下反應(yīng)2 h，所得產(chǎn)物于5 500 r/min離心10 min，依次用PBS緩沖液、碳酸鹽包被液（NaHCO30.29 g、Na2CO30.16 g、H2O 100 mL、pH 9.6）離心洗滌3 次，收集沉淀，加入50 mL碳酸鹽包被液，超聲重懸。

4）取4 mL經(jīng)碳酸鹽包被液重懸的經(jīng)戊二醛處理的SiO2納米材料按10 mg/L的比例加入親和素，4 ℃條件下?lián)u床孵育12 h，5 500 r/min離心10 min，PBS溶液離心洗滌3 次，棄上清液以除去多余親和素。

5）對氨基化的SiO2納米材料采用透射電子顯微鏡及紅外光譜儀進行表征，對親和素化的SiO2納米材料采用紫外分光光度計進行表征。

1.3.2 H2O2還原Au/SiO2的制備[28]

1）納米金的制備：取4 ℃條件下的200 mL超純水，依次加入 1 g/100mL的HAuCl4溶液3 mL，0.2 mol/L的K2CO3溶液1 mL，磁力攪拌片刻。向混合溶液中迅速加入9 mL新鮮配制的0.5 mg/mL NaBH4溶液，混合溶液由棕褐色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色，磁力攪拌5 min，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）取1.3.1節(jié)所得的親和素化的SiO2納米材料，混勻加入到20 mL酒精中，逐滴緩慢加入到180 mL新鮮配制的納米金中，磁力攪拌1 h。4 000 r/min離心12 min，超純水離心3 次，棄上清液，取沉淀超聲分散于10 mL超純水中，制得Au/SiO2納米材料。

3）配制K2CO3/HAuCl4生長液：將25 mg K2CO3溶于100 mL超純水中，磁力攪拌10 min，加入1 g/100 mL的HAuCl4溶液1.5 mL，持續(xù)攪拌20 min，4 ℃避光保存。

4）取0.132 mol/L的H2O2溶液0.1 mL，0.5 mL上述Au/SiO2納米材料，6 mL K2CO3/HAuCl4生長液，經(jīng)還原后在4 000 r/min離心12 min，取沉淀加PBS緩沖液混勻，避光保存。

5）將生物素標記的目標鏈互補配對序列2（顯示DNA）按一定濃度梯度稀釋，與上述制備好的Au/SiO2混合，37 ℃搖床中孵育12 h，得到顯示探針。

6）對H2O2還原前后的Au/SiO2采用透射電子顯微鏡及紫外分光光度計行表征。

1.3.3 表面修飾的ITO的制備

1）取1 cm×5 cm規(guī)格得導(dǎo)電玻璃ITO，分別用清洗劑、超純水、乙醇、丙酮各超聲洗滌3 次，N2吹干。

2）將ITO置于體積分數(shù)為1%的APTES-無水乙醇混合液中，室溫條件下孵育12 h，醇洗5 次，120 ℃條件下干燥3 h。

3）將ITO置于質(zhì)量濃度為15 mg/L的親和素溶液中，4 ℃搖床中孵育12 h，PBS洗板3 次，N2吹干。

4）將親和素化的ITO置于按一定濃度梯度稀釋的生物素標記的目標鏈互補配對序列1（捕捉DNA）中，37 ℃搖床中孵育12 h，PBS洗板3 次，N2吹干。

5）將上述ITO置于按一定濃度梯度稀釋的靶DNA中，37 ℃搖床中孵育12 h，PBS洗板3 次，N2吹干。

6）將上述ITO與顯示探針結(jié)合，37 ℃搖床中孵育12 h，PBS洗板3 次，N2吹干。

1.3.4 ITO表面修飾的表征及不同濃度探針的循環(huán)伏安檢測方法

1）配制鐵鉀電解液：準確稱取KCl 7.45g、K3[Fe(CN)6] 0.329 g、K4[Fe(CN)6] 0.422 g，定容至100 mL。

2）將三電極體系（以表面修飾的ITO為工作電極，以銀/氯化銀為參比電極，以鉑絲為對電極）置于上述鐵鉀電解液中，設(shè)定起始電壓-0.2 V，掃描速率100 mV/s，掃描時間60 s，機器預(yù)熱30 min后開始實驗，用循環(huán)伏安法進行檢測。

1.3.5 特異性實驗

分別對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌、阪崎桿菌進行37 ℃搖床過夜培養(yǎng)，然后將菌液按梯度稀釋，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h并計數(shù)。利用試劑盒提取所培養(yǎng)的細菌DNA，得所需的單鏈DNA。把所制備的單鏈DNA及原目標鏈、單堿基突變鏈、五堿基突變鏈作為靶DNA，按本實驗構(gòu)建的方法進行實驗，通過比較A700nm/A500nm的值來驗證特異性。

1.3.6 沙門氏菌DNA的提取與檢測

提取各個稀釋度的沙門氏菌DNA，得所需的單鏈DNA。將其作為靶DNA，按本實驗構(gòu)建的方法進行試驗，與傳統(tǒng)平板計數(shù)方法結(jié)果相比較，繪制標準曲線，找到線性范圍及最低檢測限。

1.3.7 牛奶樣品中沙門氏菌加標回收

為評價本方法的可行性，將不同濃度的沙門氏菌加入市售無菌牛奶樣品中，將所得結(jié)果與傳統(tǒng)平板計數(shù)方法結(jié)果比較，得出回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于ITO及Au/SiO2的“三明治夾心”結(jié)構(gòu)檢測沙門氏菌的原理

圖1 基于ITO及Au/SiO2的“三明治夾心”結(jié)構(gòu)檢測沙門氏菌原理圖Fig.1 Schematics of “sandwich” structure based on ITO and Au/SiO2for Salmonella detection

將生物素標記的沙門氏菌目標鏈互補配對序列1（捕捉DNA）修飾在親和素化的ITO表面，將生物素標記的目標鏈互補配對序列2（顯示DNA）修飾在親和素化的Au/SiO2復(fù)合材料表面，結(jié)合靶DNA，形成“三明治夾心”結(jié)構(gòu)，利用ITO的導(dǎo)電性以及H2O2還原金納米顆粒的信號放大作用，采用循環(huán)伏安法檢測電信號，實現(xiàn)對沙門氏菌的檢測。原理如圖1所示。

2.2 氨基化的SiO2納米材料表面修飾表征

本實驗以TEOS作為前驅(qū)物質(zhì)，氨水為催化劑，乙醇為溶劑，在恒定溫度和轉(zhuǎn)速條件下通過TEOS水解得到單分散二氧化硅粒子。通過加入APTES，引入更多的自由氨基，修飾到納米粒子表面，得到氨基化SiO2納米材料。

圖2a顯示：所制備的SiO2納米材料形成了較規(guī)則球形，直徑在80～100 nm，分散性較好，可應(yīng)用于后續(xù)實驗。由圖2b可見，1 097.3 cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰為SiO2納米材料的非對稱Si—O—Si伸縮振動峰，1 384.6 cm-1的振動吸收峰為—CH2—上的C—H不對稱振動吸收峰，1 629.5 cm-1處出現(xiàn)的振動吸收峰為一級胺的N—H剪式振動吸收峰，3 428.8 cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰為N—H的伸縮振動吸收峰，紅外圖譜表明在SiO2納米材料表面已經(jīng)成功包覆上氨基。

圖2 SiO2納米材料的TEM圖（a）和氨基化SiO2納米材料的紅外圖譜（b）Fig.2 TEM image of SiO2(a) and IR spectra of amine-functionalized SiO2(b)

2.3 Au/SiO2經(jīng)H2O2還原前后的表征

利用HAuCl4、K2CO3、NaBH4制備納米金顆粒，將SiO2納米材料與金顆粒在靜電吸附和配位作用下形成均一的Au/SiO2復(fù)合材料。圖3a顯示：金顆粒成功吸附在SiO2納米材料表面，形成Au/SiO2納米復(fù)合材料。利用H2O2的還原性，將包覆在硅球表面的金顆粒進一步還原長大，從而增強“三明治夾心”結(jié)構(gòu)生物傳感器的電信號，實現(xiàn)電信號放大檢測。圖3b顯示經(jīng)H2O2還原后，SiO2納米材料外包覆的金顆粒增大。

圖3 Au/SiO2納米復(fù)合材料（a）和H2O2還原后Au/SiO2納米復(fù)合材料（b）的TEM圖Fig.3 TEM image of Au/SiO2(a) and Au/SiO2reduced by H2O2(b)

圖4 Au/SiO2納米復(fù)合材料經(jīng)H2O2還原前（a）、后（b）的紫外-可見吸收光譜圖Fig.4 UV-Visible absorption spectrum of Au/SiO2reduced by H2O2(b) compared with normal Au/SiO2(a)

由圖4可以看出，未經(jīng)H2O2還原的Au/SiO2納米復(fù)合材料在530 nm波長處有明顯紫外吸收峰，經(jīng)H2O2還原后，金顆粒粒徑增大，在570 nm波長處有明顯紫外吸收峰，發(fā)生紅移現(xiàn)象，證明H2O2成功還原Au/SiO2，可以應(yīng)用于后續(xù)實驗。

2.4 親和素修飾SiO2納米材料及ITO的表征及優(yōu)化

“三明治夾心”結(jié)構(gòu)的DNA雜交產(chǎn)物是通過生物素化的目標鏈與經(jīng)過親和素修飾的SiO2納米材料及ITO之間特異性結(jié)合而產(chǎn)生的。因此，親和素能否成功修飾在材料表面是本實驗成功與否的基礎(chǔ)。

分別用親和素對SiO2納米材料及ITO表面進行修飾，圖5顯示親和素修飾前后親和素濃度的變化，修飾后上清液中親和素含量明顯減少，證明親和素成功修飾在SiO2納米材料及ITO表面。接著對親和素濃度進行優(yōu)化，計算親和素溶液在修飾SiO2納米材料及ITO在修飾親和素前后上清液在280 nm波長處的紫外吸光度減少量。如圖6a所示，對于SiO2納米材料，在親和素質(zhì)量濃度為10.00 mg/L時，吸光度減少最明顯，之后隨親和素質(zhì)量濃度增大差值不再發(fā)生明顯變化，說明親和素加入量飽和；而對于親和素修飾ITO而言，如圖6b所示，在親和素質(zhì)量濃度為15.00 mg/L時，吸光度減少最明顯，之后隨親和素濃度增大差值不再發(fā)生明顯變化，說明親和素加入量飽和，因此確定10.00 mg/L為SiO2微球體系的最佳親和素包被質(zhì)量濃度，15.00 mg/L為ITO的最佳親和素包被質(zhì)量濃度。

圖5 親和素修飾（a）SiO2納米材料及ITO（b）前（Ⅰ）、后（Ⅱ）的紫外-可見吸收光譜圖Fig.5 UV-Vis absorption spectra of the supernatant of SiO2(a) and ITO (b) before (Ⅰ) and after (Ⅱ) being modified by avidin

圖6 不同質(zhì)量濃度下親和素修飾SiO2納米材料（a）及ITO（b）上清液吸光度變化趨勢（λ=280 nm）Fig.6 Absorbance changes of the supernatant of SiO2NPs (a) and ITO (b) before and after being modified by different concentrations of avidin (λ=280 nm)

2.5 ITO表面修飾及表征

基于ITO的導(dǎo)電性，本實驗采用循環(huán)伏安法對ITO表面的修飾過程進行表征。從圖7可以看出，由于沒有連接任何物質(zhì)，空白ITO的導(dǎo)電性能最強，電流值最大，隨著在ITO表面進行氨基化處理、修飾親和素、連接捕捉DNA、連接靶DNA、ITO的電阻增大，導(dǎo)電性能減弱，所測得的峰電流值不斷下降（圖7中1～5線所示），同時也證明每一步目標物質(zhì)均成功修飾于ITO表面。但是，當在ITO表面連接由過氧化氫還原的Au/SiO2與顯示DNA構(gòu)成的顯示探針時，峰電流值增大（圖7中6線），這是由于Au/SiO2中的金顆粒具有導(dǎo)電性，使電極表面的導(dǎo)電性增強。

圖7 ITO自組裝生物傳感器的循環(huán)伏安曲線表征圖Fig.7 CV curves for characterization of the self-assembled ITO biosensor

2.6 沙門氏菌的檢測

利用導(dǎo)電玻璃的導(dǎo)電性，使用循環(huán)伏安法探究實驗的檢測限和線性范圍。選取10-11、10-10、10-9、10-8、10-7mol/L梯度稀釋的沙門氏菌特異寡核苷酸目標探針，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)當在一定范圍內(nèi)，隨著目標探針濃度的增大，ITO上連接的目標探針增多，ITO表面的電阻增大，峰電流隨之減小。但目標探針濃度過低時，ITO表面電阻值變化很小，所檢測到的峰電流值與空白ITO相近，達到最低檢測限。由圖8可以看出，沙門氏菌特異寡核苷酸目標探針濃度（lgc）在10-11～10-7mol/L呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.000 3x+0.000 1（R2=0.998 9），最低檢測限為6 pmol/L。

圖8 10－11～10－7mol/L沙門氏菌檢測CV（a）和標準曲線（b）圖Fig.8 CV curves of 10-11-10-7mol/L of Salmonella (a) and linear correlation in the range of 10-11-10-7mol/L of Salmonella (b)

2.7 特異性分析

依上述方法，采用相同濃度（10-7mol/L）的完全匹配靶DNA和單堿基突變鏈、五堿基突變鏈、隨機對照鏈以及提取的金黃色葡萄球菌、埃希氏大腸桿菌O157∶H7、單增李斯特菌、阪崎桿菌DNA進行檢測，比較其在按照本實驗構(gòu)建的檢測方法下，按實驗步驟將ITO修飾完全時其循環(huán)伏安曲線中的峰電流值與空白ITO的差值（ΔI），結(jié)果如圖9所示，證明本檢測方法具有良好的特異性。

圖9 本方法的特異性分析Fig.9 Specificity evaluation of this method

2.8 沙門氏菌DNA的提取與檢測

將過夜培養(yǎng)的沙門氏菌用紫外分光光度計測定600 nm處光密度（OD600nm），通過該OD600nm值推斷菌體濃度，然后對菌液進行梯度稀釋，再測定所稀釋菌液的OD600nm值，結(jié)果符合成品試劑盒的最佳提取要求。取等體積不同稀釋度的菌液進行平板計數(shù)，另一方面，取相同體積的菌液利用成品試劑盒提取沙門氏菌DNA，采用本實驗建立的方法以所提取的沙門氏菌DNA作為靶DNA進行檢測，將檢測所得結(jié)果與平板計數(shù)結(jié)果相比較，發(fā)現(xiàn)峰電流值與平板計數(shù)所得菌落個數(shù)具有良好相關(guān)性。如圖10所示，線性回歸方程為y=-1.6×10-7x+0.003 2（R2=0.994 0），線性范圍為50～7 910 CFU/mL，最低檢測限為35 CFU/mL。

圖10 菌落數(shù)與峰電流值的線性關(guān)系Fig.10 Linear relationship between colony numbers and peak point current

2.9 牛奶樣品中沙門氏菌加標回收實驗

利用本實驗建立的檢測方法及平板計數(shù)法對稀釋至不同濃度的沙門氏菌進行檢測，并比較其結(jié)果，得出回收率。結(jié)果如表1所示，由此可得本方法測得的菌落個數(shù)與傳統(tǒng)的平板計數(shù)方法所測得的結(jié)果基本統(tǒng)一，沙門氏菌的檢測回收率在93.0%～101.8%之間，回收率良好。說明本實驗所建立的沙門氏菌檢測方法比傳統(tǒng)的平板計數(shù)法準確度更高，可以應(yīng)用于實際樣品中沙門氏菌的檢測。

表1 牛奶樣品中沙門氏菌的檢測回收率Table 1 Recovery of Salmonella from spiked milk samples

3 結(jié) 論

本研究利用SiO2納米材料、納米金及ITO構(gòu)建了一種具有獨特“三明治夾心”結(jié)構(gòu)的DNA雜交生物傳感器，并利用循環(huán)伏安法進行表征并實現(xiàn)檢測。在一定范圍內(nèi)，通過加入不同濃度靶DNA，使ITO的峰電流值呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，兩者呈現(xiàn)出良好線性相關(guān)性，從而實現(xiàn)了對沙門氏菌靶DNA的檢測。本方法操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，并縮短了檢測時間，最低檢測限可達6 pmol/L。經(jīng)一系列實驗證明本方法可對沙門氏菌進行特異性檢測，所測結(jié)果與菌落具有線性相關(guān)，在最佳實驗條件下，在50～7 910 CFU/mL之間具有良好線性（R2=0.994 0），最低檢測限可達35 CFU/mL，并且所測結(jié)果與傳統(tǒng)的平板計數(shù)一致性良好，回收率在93.0%～101.8%之間。本研究為準確高效檢測沙門氏菌提供了一種新方法，具有較強應(yīng)用價值。

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Detection of Salmonella by Electrochemical Method Based on Au/SiO2Signal Amplification

SONG Liang-jing, MA Xiao-yuan, DUAN Nuo, WU Shi-jia, WANG Zhou-ping*
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Purpose: To establish a detection method with high sensitivity for Salmonella by cyclic voltammetry based on Au/SiO2signal amplification. Methods: The capture DNA and the display DNA, which are complementary with the target DNA were modified onto the surface of indium tin oxide (ITO) electrode and the surface of Au/SiO2nanoparticles. As results, capture probe and display probe were constructed. A “sandwich” structure was constructed by capture DNA-target DNA-display DNA when Salmonella target DNA was added into the system. As the content of Au/SiO2was positively correlated with the concentration of the target DNA, the peak current value of fully modified ITO could be changed by varying the concentration of the target DNA, so as to achieve the purpose of detection. Results: Under the optimal conditions, the method showed a good linear relationship when the concentration of target DNA was in the range of 10-11to 10-7mol/L, the linear regression equation was y = -0.000 3x + 0.000 1 (R2= 0.998 9), and the lowest limit of detection (LOD) was 6 pmol/L. And it showed a good linear relationship when the concentration of Salmonella was in the range of 50 to 7 910 CFU/mL, the linear regression equation was y = -1.6×10-7x + 0.003 2 (R2= 0.994 0), and the lowest LOD was 35 CFU/mL. Conclusions: The specificity and spiked recovery experiments proved that this method could be used for the detection of actual samples.

food analysis; Salmonella; gold nanoparticles; silicon dioxide (SiO2); cyclic voltammetry

TS207.3

A

1002-6630（2014）08-0050-07

10.7506/spkx1002-6630-201408009

2014-03-29

國家自然科學(xué)基金面上項目（21375049）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2012614）；

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2012BAK08B01）

宋靚婧（1989—），女，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：kwonleesong@163.com*

王周平（1974—），男，教授，博士，研究方向為食品安全檢測。E-mail：wangzp@jiangnan.edu.cn