李建武，宋春美，劉 芳，吳淑燕，李浩林，劉 程，邱 實，曾海娟，吳 嫚，劉 箐,*

免疫層析試紙技術(shù)及其在食品安全檢測中的應(yīng)用

李建武1，宋春美1，劉 芳2，吳淑燕1，李浩林3，劉 程3，邱 實1，曾海娟1，吳 嫚1，劉 箐1,*

（1.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；2.甘肅出入境檢驗檢疫局國際旅行衛(wèi)生保健中心，甘肅 蘭州 700030；3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

免疫層析試紙因其使用方便，耗時少，結(jié)果穩(wěn)定，價格相對低廉，可適用現(xiàn)場和家庭檢測，在臨床診斷等領(lǐng)域得到了有效普及。近年來，隨著食品安全事故頻發(fā)，該技術(shù)在食品安全檢測中得到快速廣泛的應(yīng)用。本文從免疫層析試紙技術(shù)的簡介、研究、應(yīng)用進展等方面進行綜述，并對其發(fā)展前景 進行評述，以期 為免疫層析 試紙技 術(shù)的未來發(fā)展及應(yīng)用提供參考。

免疫層析試紙；食品安全；檢測；應(yīng)用

1 免疫層析試紙技術(shù)簡介

免疫層析技術(shù)是2 0世紀80年代初在發(fā)達國家先興起的一種快速檢測技術(shù)，其原理是在毛細管層析作用下，抗原和抗體在硝酸纖維素膜上特異性結(jié)合。而免疫層析試紙條就是在免疫層析技術(shù)基礎(chǔ)上，用膠體金、磁性納米材料、乳膠微球、稀土納米材料、量子點、熒光素等材料標記，肉眼或者在紫外或紅外光的激發(fā)條件下，能夠 呈現(xiàn)出抗體和抗原特異性結(jié)合的顏色或者熒光區(qū)域。免疫層析試紙條在不斷的創(chuàng)新和發(fā)展，不僅出現(xiàn)了各式各樣的標記材料，也研發(fā)了多種光電聯(lián)合檢測儀器；從之前檢測結(jié)果只能靠肉眼判定的半定量檢測到現(xiàn)在的儀器直接定量讀取，不僅提高了檢測靈敏度，也減少了對弱陽性檢測結(jié)果的重新判定。

近來食品安全事件時有發(fā)生，如2013年新西蘭奶粉事件，在奶粉中發(fā)現(xiàn)肉毒桿菌、雙氰胺、三聚氰胺；2013年臺灣的毒淀粉事件，淀粉中含有順丁烯二酸，1 名體質(zhì)量60 kg的成年人1 年吃下20 片含有毒淀粉的雞排，就可能不孕或影響腎臟功能；2011年河南的瘦肉精事件，采用違禁動物藥品“瘦肉精”飼養(yǎng)生豬，而且有毒豬肉流入濟源雙匯食品有限公司。這些食品的安全事件已經(jīng)嚴重危害到了人體健康，要保證食品質(zhì)量與安全，必須放棄先前操作繁瑣、耗時長、成本高的物理、化學(xué)等檢測方法，利用生物學(xué)特異性識別方法，快速、精確、靈敏、較高選擇性的檢測出食品中的食源性致病菌、農(nóng)獸藥殘留、違禁添加劑、生物毒素、重金屬離子等對人體有害的物質(zhì)?，F(xiàn)代食品安全檢測的生物技術(shù)有DNA探針、聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、生物芯片、免疫層析試紙及酶聯(lián)免疫吸附劑測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等技術(shù)，免疫層析試紙技術(shù)相對其他生物檢測技術(shù)而言，具有能快速檢測、靈敏、成本相對低廉、結(jié)果穩(wěn)定、操作方便，可進行現(xiàn)場檢測的優(yōu)點。本文主要從免疫標記材料、試紙條式樣多元化、學(xué)科交叉等方面，闡述了免疫層析試紙技術(shù)在食品安全檢測中的研究、應(yīng)用新進展。

免疫層析試紙主要由樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜、T線（檢測線）、C線（質(zhì)控線）、吸水墊、聚氯乙烯（polyvinl chloride，PVC）底板等部分組成，如圖1所示。以膠體金免疫層析試紙條原理為例，根據(jù)抗體和抗原結(jié)合方式不同原理分為雙抗夾心法和競爭法。雙抗夾心法檢測原理是當樣品點到樣品墊上，利用毛細管層析作用，樣品中的抗原先會經(jīng)過膠體金標記過的抗體的結(jié)合墊，與金標抗體特異性結(jié)合，繼續(xù)層析，當遇到T線時，抗原會再次被T線上的抗體捕捉，過量的金標抗體會繼續(xù)層析，被C線上抗體捕捉，所以當T線變紅，C線也變紅，說明是陽性；當T線不變，C線也變紅，說明是陰性；當C線不變，說明試紙條失效，競爭法顯色結(jié)果與之相反。

圖1 免疫層析試紙條結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structural diagram of immunochromatographic strip

2 免疫層析試紙技術(shù)研究進展

2.1 免疫標記材料

在食品安全檢測方面，如各種食源性致病菌的篩選檢測，利用免疫層析試紙的快速、簡便、靈敏的優(yōu)點，在一些基層單位中得到廣泛的應(yīng)用。由免疫層析試紙示意圖可知，關(guān)鍵技術(shù)在于標記抗體的免疫標記材料，免疫層析試紙技術(shù)隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不斷的創(chuàng)新，出現(xiàn)了各式各樣的標記材料，每種標記材料都有各自的優(yōu)缺點，它們不會改變標記抗體的生物特性，并都能顯示一定的顏色，便于觀察和儀器讀取。下面主要介紹膠體金、磁性納米顆粒、乳膠微球、稀土納米材料、量子點、熒光素。

2.1.1 膠體金

膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負電的疏水膠溶液，由于靜電作用而成為穩(wěn)定的膠體狀態(tài)。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。

用膠體金作為免疫標記材料，在免疫層析試紙技術(shù)方面是比較成熟的一項標記技術(shù)，Anfossi等[1]通過優(yōu)化膠體金免疫層析技術(shù)，雖不精確但能夠短時超靈敏檢測牛奶中的黃曲霉M1；近來，有一些新型膠體免疫層析金技術(shù)出現(xiàn)，把膠體金做出柱形、三角形等其他形狀，突破了傳統(tǒng)的球形膠體金，Zhu Yingyue等[2]把膠體金顆粒做成柱形，檢測抗生素（慶大霉素），能夠簡單、快速、靈敏地檢測到0.05 ng/mL。

2.1.2 磁性納米材料

磁性納米顆粒是大小處在納米級的磁性材料（代表Fe3O4），具有良好的磁導(dǎo)向性、生物相容性，容易制備，理化性質(zhì)穩(wěn)定，能與多種生物分子（酶、蛋白質(zhì)等）耦合，當它與單克隆抗體耦合時，利用能與抗原的特異性結(jié)合這一特性，形成免疫磁珠?，F(xiàn)在利用免疫磁珠技術(shù)做成免疫層析試紙在臨床檢驗中應(yīng)用比較廣泛，孫建斌等[3]建立了HCG納米磁性免疫層析試紙條，用于早孕檢測，檢測到底線為1 mIU/mL的HCG抗原，檢測靈敏度高，并且在5 min內(nèi)檢測完畢。Liu Chunyan等[4]應(yīng)用納米磁性顆粒標記的免疫層析法，研制可快速半定量檢測對氧磷農(nóng)藥殘留免疫層析試紙條，最低限度檢測為1.7 ng/mL。

2.1.3 乳膠微球

乳膠微球可分為彩色乳膠微球和熒光乳膠微球，彩色乳膠微球具有分散性好、粒徑分布窄、色彩鮮艷等特性，在免疫層析試紙技術(shù)中得到了有效的應(yīng)用，蔣韜等[5]建立口蹄疫O、Asia1分型彩色膠乳試紙條診斷方法，此免疫層析試紙條有很好的靈敏度，可檢測到病毒含量為3.9×104LD50，特異性好，無交叉反應(yīng)。熒光乳膠微球需要紫外激發(fā)，崔浩等[6]基于免疫競爭層析法原理，建立了萊克多巴胺的熒光膠乳顆粒免疫層析快速檢測技術(shù)，用于豬肉組織中萊克多巴胺殘留的檢測，最低檢測限為0.5 μg/mL，與其他結(jié)構(gòu)類似物無交叉操作簡便、穩(wěn)定可靠、靈敏度高。

2.1.4 稀土納米材料

稀土納米材料根據(jù)斯托克斯位移方向不同，分為上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料和下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料。上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即反斯托克斯發(fā)光材料，由于稀土金屬元素（主要是鑭系）摻雜于惰性氧化物材料，紅外線激發(fā)下可發(fā)射不同波長的可見光，且吸收長波長光而發(fā)射短波長光，對生物組織（抗體）無損傷，無背景熒光并具有良好的光穩(wěn)定性，因此在生物技術(shù)方面?zhèn)涫荜P(guān)注。雷皖秋[7]研究了上轉(zhuǎn)換發(fā)光免疫層析法定量測定HBsAg的試紙條，在無償獻血者獻血前血液篩檢中的應(yīng)用，檢測血液中HBsAg靈敏度為0.5 IU/mL，敏感性為76.92%，特異性為100.00%，符合性85.00%。

下轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即斯托克斯發(fā)光材料，是自然界常見的發(fā)光現(xiàn)象，由高能量的光如紫外線激發(fā)產(chǎn)生低能量的光如可見光，中間存在能量損失。陳明山等[8]建立一種檢測尿液中甲基苯丙胺物質(zhì)的高靈敏度檢測方法，研制出甲基苯丙胺稀土熒光試紙條，用所制備的試紙條檢測尿液中的甲基苯丙胺，經(jīng)紫外光激發(fā)下，肉眼和儀器判讀的敏性均為100 ng/mL，與嗎啡、氯胺酮、苯丙酮、可卡因等無交叉反應(yīng)。

2.1.5 量子點

量子點，是一種由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素組成、能夠被激發(fā)照射產(chǎn)生熒光的半導(dǎo)體納米顆粒，其中研究較多的主要是CdX（X=S、Se、Te）。由于量子點顯著的尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，致使它具有獨特的光吸收特性，主要體現(xiàn)在量子點的尺寸大小可以控制發(fā)射光譜，不同尺寸的量子點被同一波長的光激發(fā)會發(fā)射出不同顏色的光。與一般熒光染料相比，量子點的激發(fā)波長很寬，被激發(fā)后能夠產(chǎn)生窄而對稱的發(fā)射光譜，其激發(fā)光譜寬而不對稱，從而避免了去尋找合適波長的光源。

近年來，由于量子點熒光強度好，穩(wěn)定性好，可以接受多次激發(fā)，熒光壽命長，具有較好的生物相容性，而且標記生物大分子后不影響原有的特性，這諸多優(yōu)勢已經(jīng)引起了許多科學(xué)研究者的關(guān)注，發(fā)光量子點作為熒光標記探針生物大分子在臨床檢驗、食品安全檢測中具有巨大的潛力和應(yīng)用價值。郭利寧等[9]建立的CdTe量子點免疫熒光層析試紙條檢測抗CCP抗體（抗環(huán)瓜氨酸多肽）的靈敏度為97.5%，特異性為95.8%，該方法操作簡單、快速，可實現(xiàn)床旁檢測，能應(yīng)用于類風濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷。

2.1.6 熒光素

熒光素是具有熒光特性的染料，種類主要有：異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)、鑭系6 類。一般熒光素價格低廉，表面不需要修飾可以直接偶聯(lián)生物特性抗體，但用熒光素作為免疫標記材料在免疫層析試紙技術(shù)中應(yīng)用很少，國內(nèi)外也有些相關(guān)報道，宋春美等[10]用FITC標記萊克多巴胺單克隆抗體，快速檢測萊克多巴胺的殘留，檢測試紙的最低檢出限為1 μg/L，與其他動物劑類藥物無交叉反應(yīng)具有良好的特異性和靈敏度。

2.2 檢測模式

免疫層析試紙技術(shù)根據(jù)檢測需求不同，而檢測模式也各色各樣，可分為單檢和多檢。

2.2.1 單檢試紙

單檢是每根試紙條上面只有一條T線（檢測線），一條C線（質(zhì)控線）?，F(xiàn)在的很多免疫層析試紙條都是單檢，因為單檢的檢測結(jié)果非常準確，可靠性高，靈敏度高，假陽性少，現(xiàn)象比較明顯，但如果大批量檢測時單檢與多檢相比就會顯得過程很復(fù)雜，浪費抗體和NC膜等材料。

2.2.2 多檢試紙

多檢是每根試紙條上面有兩條或兩條以上的T線（檢測線），一條C線（質(zhì)控線）。一條試紙條可以檢測多種物質(zhì)，提高了檢測效率，節(jié)約了檢測材料，但降低了檢測靈敏度，當一些有害物質(zhì)在稍微低些的濃度就無法檢測。Guo Yirong等[11]研制出膠體金試紙條的雙檢，同時快速檢測水樣中殺蟲劑卡巴呋喃和農(nóng)藥三唑磷，最低檢測限分別是32 μg/L和4 μg/L。

2.3 試紙外型

現(xiàn)在免疫層析試紙條外型的不斷創(chuàng)新，出現(xiàn)了各種各樣的試紙條，而不同組裝試紙條方式也很多，有雙層析通道復(fù)合試紙條、十層析通道復(fù)合試紙條，可以同時檢測出樣品中含有兩種或兩種以上的物質(zhì)。

2.3.1 雙向?qū)游鲈嚰?/p>

為了方便加樣，梁新苗等[12]設(shè)計了雙向?qū)游鲈嚰垼鐖D2所示，進一步節(jié)約了材料，并實現(xiàn)常見葫蘆科病毒的檢測，與傳統(tǒng)的檢測方法程序相比，操作簡單，檢測時間減少，檢測結(jié)果特異性和靈敏度都很好。這樣降低檢測成本，提高了經(jīng)濟效益。

圖2 雙向?qū)游鲈嚰團ig.2 Dual channel complex chromatographic test strip

2.3.2 十通道免疫層析試紙

十通道免疫層析試紙是把十根試紙條放到一個具有10 個試紙槽的試紙盤上。在中間加樣區(qū)設(shè)置了一個試紙槽的引流片，保證統(tǒng)一加樣時，可以保證樣品均勻流入各個試紙槽，從而能夠同時均勻?qū)游?。Hong Wenyan等[13]設(shè)計了十通道免疫層析試紙，如圖3所示，從操作方面考慮，方便了檢測操作；從檢測效果方面考慮，它與單通道免疫層析試紙的檢測靈敏度和特異性一致，而且每個通道發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)不影響其他通道的特異性。

圖3 十通道免疫層析試紙Fig.3 Ten channel complex chromatographic test strip

2.4 檢測手段

用生物技術(shù)作為檢測技術(shù)，在臨床檢驗和食品安全檢測方面應(yīng)用比較廣泛，檢測手段不斷創(chuàng)新，利用交叉學(xué)科的儀器應(yīng)用，通過與光電傳感器或者STM32單片機和TCS3200顏色識別器等其他儀器聯(lián)用，能夠從原來的定性檢測到現(xiàn)在的定量檢測。Zhang Hongcai等[14]把膠體金免疫層析試紙條與光電傳感器聯(lián)用，此光電型傳感器檢測器具有簡便、快速、靈敏、特異性強的優(yōu)點，能夠進行定量檢測，檢測范圍變大。程華等[15]研制了一種以STM320單片機為運算、控制核心，以顏色識別傳感器TCS3200進行數(shù)據(jù)采集的檢測儀，能夠?qū)Χ喾N膠體金免疫層析試紙條進行定量分析，實現(xiàn)了試紙條的智能檢測。

3 免疫層析試紙技術(shù)應(yīng)用進展

免疫層析試紙技術(shù)起先應(yīng)用在臨床醫(yī)學(xué)診斷，主要檢測疾病，如利用膠體金免疫層析法可以檢測出乙型肝炎病毒表面抗原、口蹄疫病毒、禽流感病毒、傳染性法氏囊病毒VP4蛋白，檢測人絨毛膜促性腺激素（血清HCG）等。在食品安全檢測中，發(fā)現(xiàn)使用免疫層析試紙技術(shù)可以迅速、精確的判斷出食品中存在潛在的危害，而且這種方法簡單、方便、成本低，避免使用高效液相色譜等高端昂貴儀器，起到經(jīng)濟環(huán)保的作用。

3.1 檢測食品中食源性致病菌

由食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件很大程度是食物被污染，產(chǎn)生一些致病菌導(dǎo)致人體食物中毒。要避免此類食品安全事件發(fā)生，就要對食品安全進行檢測，而免疫層析試紙技術(shù)既迅速又廉價，必然成為未來食品安全檢測技術(shù)的主流。免疫層析試紙技術(shù)能在很少的時間內(nèi)準確無誤檢出食源性致病菌，研制出檢測各種各樣食源性致病菌的免疫層析試紙條，歸納如表1所示。

表1 免疫層析試紙條在食品中食源性致病菌檢測方面的應(yīng)用Table 1 Applications of immunochromatographic test strip in detection of foodborne pathogens

3.2 檢測食品中農(nóng)獸藥殘留

食品中農(nóng)獸藥殘留一直是人類非常關(guān)心的食品安全問題之一，現(xiàn)在安全檢測成為控制含有農(nóng)獸藥的食品流入市場的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。必須嚴格把關(guān)，杜絕含有這類食品進到餐桌。用免疫層析試紙條方法檢測農(nóng)獸藥殘留已經(jīng)相當普及，歸納如表2所示。

表2 免疫層析試紙條在食品中農(nóng)獸藥殘留檢測方面的應(yīng)用Table 2 Applications of immunochromatographic test strip in detection of pesticide and veterinary drug residues in foods

3.3 檢測食品中違禁添加劑

現(xiàn)在某些商家為了自身利益最大化，不斷的使用違禁添加劑，如養(yǎng)豬的商人給豬喂瘦肉精，養(yǎng)魚的使用孔雀石綠，還有一些在奶粉中添加三聚氰胺等。這就要對監(jiān)管部門嚴格檢查，而且對于以前的傳統(tǒng)方法（高效液相色譜法）檢測儀器要求高、耗時長、成本高。當前，用免疫層析試紙快速檢測節(jié)約了成本和節(jié)省時間，降低了操作要求，檢測效果也相當好。在檢測違禁添加劑的應(yīng)用中歸納如表3所示。

表3 免疫層析試紙條在食品中違禁添加劑檢測方面的應(yīng)用Table 3 Applications of immunochromatographic test strip in detection of prohibited additives in foods

3.4 檢測食品中生物毒素

食品原料有時由于不正確的處理和貯藏，會產(chǎn)生一些天然毒素。有時誤食會引起人類中毒甚至導(dǎo)致死亡。用免疫層析試紙檢測生物毒素，在食品安全檢測中已經(jīng)被投入使用了，歸納如表4所示。

表4 免疫層析試紙條在食品中生物毒素檢測方面的應(yīng)用Table 4 Applications of immunochromatographic test strip in detection of biotoxins in foods

3.5 檢測食品中重金屬離子

對于食品中的重金屬離子檢測傳統(tǒng)方法是化學(xué)滴定、原子熒光、原子吸收、原子發(fā)射、石墨爐、ICP-MS等這些都可以測定，而現(xiàn)在利用生物免疫層析試紙技術(shù)進行快速檢測已不罕見了，歸納如表5所示。

表5 免疫層析試紙條在食品中金屬離子檢測方面的應(yīng)用Table 5 Applications of immunochromatographic test strip in detection of metal ions in foods

4 展 望

免疫層析試紙目前存在的主要問題是定量問題，縱觀免疫層析試紙在食品安全中的應(yīng)用，試紙只能進行半定量的檢測，相對于定性檢測有了很大的突破。但是這并不能體現(xiàn)出成熟的免疫層析試紙技術(shù)水平，定量檢測是免疫層析試紙技術(shù)的最終目標。對于靈敏度，利用新型標記材料，如量子點、稀土發(fā)光材料、上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料、熒光素等已經(jīng)使得免疫層析試紙的靈敏度有了一定的提高，一些已經(jīng)突破了ELISA和膠體金試紙的靈敏度；除此之外，利用免疫層析試紙檢測時，配合新型生物傳感器的使用，會達到放大檢測信號的作用，從而提高靈敏度，同時實現(xiàn)檢測手段的多樣化。

免疫層析試紙作為快速檢測領(lǐng)軍先鋒發(fā)展迅猛，依然面臨著一些限制其發(fā)展的問題，如靈敏度不及儀器分析法、多元檢測少、定量分析能力弱等?，F(xiàn)今國內(nèi)外免疫層析試紙條技術(shù)較成熟應(yīng)用最廣泛的是膠體金免疫層析試紙條，隨著生物技術(shù)、納米技術(shù)、光電技術(shù)的發(fā)展及各學(xué)科的交叉融合，會有越來越多的新型標記材料、新型抗體、新型檢測模式以及新型便攜化、微型化、自動化的定量檢測儀器出現(xiàn)，用于改善現(xiàn)有免疫層析試紙的各項性能，使免疫層析試紙在食品安全檢測領(lǐng)域中發(fā)揮著不可替代的作用，為食品安全事業(yè)做出更大的貢獻。

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Immunochromatographic Strip Technology and Its Application in Food Safety Detection

LI Jian-wu1, SONG Chun-mei1, LIU Fang2, WU Shu-yan1, LI Hao-lin3, LIU Cheng3, QIU Shi1, ZENG Hai-juan1, WU Man1, LIU Qing1,*
(1. School of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and T echnology, Shanghai 200093, China; 2. International Travel Health Care Center, Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lanzhou 700030, China; 3. School of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Immunochromatographic strip has been popularly used in clinical diagnosis and other areas because of its ease operation, less time-consuming, stable results, relative inexpensiveness and applicability for in situ and domestic testing. As food safety incidents have occurred frequently in recent years, thi s technology has been widely used in rapid food safety testing. In this paper, we overview immunochromatographic strip technology and its recent applications, and discuss its future prospects. We expect that this review will provide useful references for the future development and application of this technology.

immunochromatographic strip; food safety; detection; application

TS201.6

A

1002-6630（2014）08-0036-06

10.7506/spkx1002-6630-201408007

2014-04-11

上海市科委重點支撐項目（13430502400）；甘肅省科技支撐計 劃項目（1304FKCA056）；

國家質(zhì)檢總局科技項目（GSCIQ_2010IK220）

李建武（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品安全檢測。E-mail：812391836@qq.com

*通信作者：劉箐（1970—），男，教授，博士，研究方向為食源性致病菌致病機理及快速檢測技術(shù)。E-mail：liuq@usst.edu.cn