吳亞君，王 斌，劉鳴暢，韓建勛，李新實(shí)，陳 穎

阿膠中馬和驢成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)

吳亞君，王 斌，劉鳴暢，韓建勛，李新實(shí)，陳 穎*

（中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品安全研究中心，北京 100123）

建立阿膠中馬和驢成分高特異、高靈敏的實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)方法。選擇馬和驢線粒體基因tRNA-Thr及D-loop區(qū)為靶序列，設(shè)計(jì)合成特異引物，通過普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，結(jié)果表明，這兩對(duì)引物能夠準(zhǔn)確檢測(cè)阿膠或動(dòng)物膠中馬和驢成分。

阿膠；馬；驢；實(shí)時(shí)熒光PCR

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

馬血清、驢血清來自山東出入境檢驗(yàn)檢疫局；駱駝肉、豬肉、牛肉、貂肉、狗肉、雞肉、鹿茸、貓肉、狍子肉、鼠肉、兔肉、鴨肉、羊肉、魚肉、大豆、大米、玉米、黃瓜、胡蘿卜為本實(shí)驗(yàn)室收集樣品。正品阿膠塊、未知來源的阿膠樣品（1～6）。

1.1.2 試劑

DNeasy Mericon Food Kit（50）試劑盒（貨號(hào)：69514）德國Qiagen公司；Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒（貨號(hào)：FF3751） 美國Promega公司；Nucleospin Food試劑盒（貨號(hào)：74094550） 德國MN公司；十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）提取液（54.9 mmol/L CTAB、1.4 mol/L NaCl、0.1 mol/L Tris-HCl、0.02 mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），pH 8.0）、CTAB沉淀液（13.7 mmol/L CTAB、40 mmol/L NaCl）、無水乙醇、PCR預(yù)混液（TaqManGene Expression Master Mix，貨號(hào)：4369016） 美國ABI公司；蛋白酶K（20 mg/mL，貨號(hào)：P6556-100MG）美國Sigma公司；DNA 1000 LabChip（貨號(hào)：5067-1504） 美國Agilent公司；滅菌水。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Reriti 96Well Thermal Cycler PCR儀、7500 Real Time PCR System實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國ABI公司；2100 Bioanalyzer毛細(xì)管芯片電泳儀 美 國Agilent公司。

細(xì)胞按前述分組處理后，移除內(nèi)培養(yǎng)基(用于后續(xù)LDH酶活性測(cè)定)并加入100 μL的MTT試劑(終質(zhì)量濃度：0.5 mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄上清液，每孔加入DMSO (100 μL)避光振蕩30 min，測(cè)定OD490 nm后按公式：細(xì)胞生存率(%)＝OD樣品組/OD正常組×100來計(jì)算細(xì)胞生存率。LDH脫氫酶水平采用比色試劑盒按照說明書操作要求進(jìn)行測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 D NA提取

血清、肌肉、植物樣品采用CTAB法[10-11]：取1 g樣品粉末到50 mL離心管中，加入5 mL CTAB提取緩沖液和20 μL蛋白酶K，渦旋混勻65 ℃孵育過夜，將樣品管12 000×g離心10 min。吸取1 mL上清液到新的2 mL離心管中，加入700 μL三氯甲烷振蕩混勻，14 500×g離心10 min，吸取600 μL上清到新的2 mL離心管中，加入1 200 μL CTAB沉淀緩沖液，混勻室溫孵育60 min，14 500×g離心10 min棄去水相，加入350 μL 1.2 mol/L NaCl溶液溶解沉淀，加入350 μL三氯甲烷振蕩混勻，14 500×g離心10 min，吸取200 μL上清液到新的1.5 mL離心管中，加入160 μL 異丙醇混勻后室溫孵育20 min，14 500×g離心10 min，棄去水相，加入500 μL 70%乙醇混合沖洗沉淀，14 500×g離心10 min，棄去水相室溫晾干，加入100 μL 0.1×TE緩沖液65 ℃、10 min溶解DNA。

阿膠樣品采用試劑盒法，起始樣品量200 mg，DNA溶于100 μL無菌雙蒸水。

1.2.2 常規(guī)PCR

PCR反應(yīng)體系：DNA模板5 μL；10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5 μL；dNTPs 2.0 μL；上下游引物（10 pmol/L）各0.5 μL；Taq酶1 U，用無菌水補(bǔ)至總體積為25 μL。

PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.2.3 毛細(xì)管芯片電泳

電泳操作按照DNA 1000 LabChip 試劑盒所提供的說明進(jìn)行。凝膠-染料混合物的準(zhǔn)備：將試劑盒中DNA Dye Concentrate及DNA Gel Matrix試劑室溫放置30 min，渦旋振蕩DNA Dye Concentrate試劑，取25 μL DNA Dye Concentrate至DNA Gel Matrix試劑中，混勻充分后，用離心過濾器過濾（1 500×g、10 min）。將凝膠-染料混合物注入分離芯片中，將5 μL Marker加入各個(gè)樣品孔中。取上述PCR產(chǎn)物各1 μL分別加入12個(gè)樣品孔中，將1 μL Ladder加入指定的Ladder孔中，最后將芯片渦旋混勻后放入毛細(xì)管芯片電泳儀中進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)分析。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR[6,12-13]

25 μL PCR體系：12.5 μL Master Mix、6.0 μL ddH2O、0.5 μL 10 μmol/L引物、0.5 μL 10 μmol/L探針、5 μL模板，引物探針序列見表1。

PCR程序：50 ℃去除RNA 2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火1 min，50個(gè)循環(huán)。

表1 檢測(cè)用引物和探針Table 1 Specific primers and probes of real-time PCR amplification

2 結(jié)果與分析

對(duì)馬和驢線粒體基因組進(jìn)行序列比對(duì)后挑選的靶序列（NC_001788.1、KC203030.1），為tRNA-thr和D-loop區(qū)，見圖1。馬和驢的探針長度為28 個(gè)堿基，其中8 個(gè)為差異堿基。正向引物23 個(gè)堿基，其中在5’端有1 個(gè)差異堿基，反向引物22 個(gè)堿基，靠近3’端有3 個(gè)差異堿基。

圖1 馬和驢線粒體靶序列比對(duì)結(jié)果Fig.1 Sequence alignment of mitochondrial target genes for horse and donkey

采用常規(guī)PCR法對(duì)馬和驢等11種動(dòng)物基因組的擴(kuò)增結(jié)果見圖2。兩對(duì)引物對(duì)的PCR產(chǎn)物長度108 bp，與電泳結(jié)果一致。馬特異性引物僅對(duì)馬DNA有擴(kuò)增，驢特異性引物僅對(duì)驢DNA有擴(kuò)增，說明兩對(duì)引物特異性良好。

圖2 馬（A）和驢（B）特異性引物常規(guī)PCR產(chǎn)物毛細(xì)管芯片電泳結(jié)果Fig.2 Microchip capillary electrophoresis by using horse and donkey specific primers for routine PCR amplification

增加探針后馬和驢特異性體系的擴(kuò)增結(jié)果見圖3。實(shí)驗(yàn)對(duì)象包括馬和驢等16 種動(dòng)物以及5 種植物。其中馬特異性體系僅對(duì)馬DNA樣本有擴(kuò)增，驢特異性體系僅對(duì)驢DAN樣本有擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線呈典型S型，所有樣本3 次平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)良好。說明設(shè)計(jì)的馬和驢特異性實(shí)時(shí)熒光PCR體系特異性良好。

圖3 馬和驢實(shí)時(shí)熒光PCR特異性結(jié)果Fig.3 Specificity for horse and donkey ingredients by real-time PCR

將馬和驢DNA質(zhì)量濃度分別調(diào)整至0.1 ng/?L后，按比例混合，使馬和驢的體積百分比分別為100%、90%、50%、10%、1%、0.1%。混合DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果見圖4，馬特異性體系的相對(duì)靈敏度達(dá)到0.1%，即500 pg模板DNA中檢測(cè)到0.5 pg馬DNA。驢特異性體系的相對(duì)靈敏度達(dá)到1%，即500 pg模板DNA中檢測(cè)到5 pg驢DNA。

為了了解不同DNA提取方法對(duì)阿膠的適用性，分別采用DNeasy Mericon Food Kit（50）試劑盒、Wizard Magnetic DNA Purification System for Food試劑盒、Nucleospin Food試劑盒，以及CTAB法對(duì)阿膠進(jìn)行DNA提取，每份DNA重復(fù)擴(kuò)增8 次，上述方法的擴(kuò)增率分別為4/8、2/8、8/8和1/8（結(jié)果未示），Nucleospin Food的擴(kuò)增率明顯高于其他方法，適合阿膠樣品的檢測(cè)。

圖4 馬和驢特異性體系相對(duì)靈敏度Fig.4 Relative response of horse and donkey specific systems

采用建立的實(shí)時(shí)熒光PCR體系對(duì)正品阿膠及某公司送檢的6 批阿膠樣品的檢測(cè)，結(jié)果見表2。正品阿膠樣品只檢出驢成分，未知來源的6 個(gè)阿膠樣品存在不同程度的摻雜情況，其中4 個(gè)樣品未檢出驢成分。

表2 未知來源阿膠樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Results obtained by real-time PCR for the detection of unknown donkey glue samples

3 討論與結(jié)論

阿膠的傳統(tǒng)加工工藝很復(fù)雜，包括晾皮、刮皮、泡皮、鍘皮、化皮、打沫、濃縮、凝膠、切膠、晾膠、擦膠[1-15]。對(duì)阿膠進(jìn)一步加工成口服液和顆粒沖劑的過程中需要進(jìn)一步酶解、純化、干燥等，因此從新鮮的動(dòng)物皮張到最終的產(chǎn)品需要經(jīng)過高強(qiáng)度的加工，對(duì)DNA的破壞尤為嚴(yán)重。硅膠膜類試劑盒經(jīng)過許多研究者的驗(yàn)證[16-17]，在深加工食品核酸的提取方面性能很好。其核心是硅樹脂，通常為親水、多孔的硅膠珠，硅膠珠表面包被堿性基團(tuán)，在酸性條件下可以產(chǎn)生高密度的正電荷，使DNA骨架上帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)高特異性地結(jié)合在硅膠珠上，獲得的核酸純度很高，對(duì)碎片核酸的富集也很有效，這對(duì)于成分復(fù)雜的加工食品樣品尤為有利。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同來源阿膠塊樣品的成功檢測(cè)說明該類試劑盒的適用性。

此外，由于食品加工過程中高溫高壓對(duì)DNA造成很大破壞，因此檢測(cè)體系通常選擇高拷貝的短序列作為目標(biāo)物。動(dòng)物成分檢測(cè)中線粒體是優(yōu)先選擇的對(duì)象，因?yàn)榭截悢?shù)多（1 000～2 000 個(gè)/細(xì)胞，每個(gè)線粒體基因組數(shù)百個(gè)拷貝），進(jìn)化適中（能很好地反映物種特征）[18]。由于馬和驢物種非常相近，對(duì)其線粒體序列的比對(duì)結(jié)果顯示兩者相似度92.4%，因此采用了線粒體全序列比對(duì)，尋找適合引物探針設(shè)計(jì)的差異集中區(qū)域的方式，找到了覆蓋tRNA-Thr和D-loop區(qū)的一段序列，成功設(shè)計(jì)了滿足要求的馬特異性引物探針體系和驢特異性引物探針體系。

近年在食品真?zhèn)魏唾|(zhì)量評(píng)價(jià)領(lǐng)域有許多新型的技術(shù)得到應(yīng)用。瞿海斌等[3]采用近紅外光譜技術(shù)對(duì)阿膠真品和偽品進(jìn)行快速區(qū)分。近紅外等快速無損技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)是快速和無損，但是由于真品和偽品之間往往缺乏特征性指標(biāo)，容易對(duì)未知樣品造成誤判，而且加工工藝、原料來源、樣品顆粒均一性等也可能影響樣品數(shù)據(jù)，造成聚類的偏差。而且很多偽品在熬制過程中會(huì)加入少量阿膠，將對(duì)光譜數(shù)據(jù)造成干擾。DNA檢測(cè)技術(shù)對(duì)食品原料物種來源的判別具有唯一性、不受加工和混雜影響等特點(diǎn)，能夠準(zhǔn)確判定食品真?zhèn)巍?/p>

阿膠作為我國“中藥三寶”之一，在我國保健食品市場占據(jù)重要地位[19]。近年來阿膠也開始進(jìn)入國外市場[20]，例如2006年9月26日首次獲準(zhǔn)加拿大衛(wèi)生部的中藥產(chǎn)品藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范證書注冊(cè)，進(jìn)入了加拿大的藥品市場。在阿膠的質(zhì)量監(jiān)管中，對(duì)原料的控制尤為重要，雖然目前對(duì)阿膠的藥理仍在研究中，但上千年的實(shí)踐已證實(shí)驢皮作為阿膠原料所具有的獨(dú)特效果，同時(shí)出于消費(fèi)者知情權(quán)和利益的保護(hù)，也應(yīng)當(dāng)保證阿膠原料的真實(shí)性。對(duì)送檢樣品的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)普遍存在的摻雜甚至假冒現(xiàn)象，說明對(duì)阿膠原料監(jiān)管十分必要和緊迫。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)線粒體tRNA-Thr和D-loop區(qū)序列，建立了阿膠中馬和驢成分的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，此法特異性高、靈敏度高，能準(zhǔn)確檢測(cè)阿膠中的馬和驢成分，為市售商品的監(jiān)管及食品化妝品藥品生產(chǎn)企業(yè)的原料質(zhì)控提供快速準(zhǔn)確的技術(shù)手段。

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A Real-Time PCR to Detect Horse and Donkey Ingredients in Donkey Hide Glue

WU Ya-jun, WANG Bin, LIU Ming-chang, HAN Jian-xun, LI Xin-shi, CHEN Ying*
(Agro-product Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China)

In this study, we established a highly specific and sensitive real-time polymerase chain reaction (PCR) method to detect horse and donkey components in donkey hide glue. The mitochondrial tRNA-Thr gene of horse and the mitochondrial D-loop region of donkey were selected as target sequences for the designing of specific primers. In conventional and realtime PCR assays, horse and donkey ingredients could be specifically detected using both primer pairs.

donkey hide glue; horse; donkey; real-time polymerase chain reaction (PCR)

R282.5

A

1002-6630（2014）08-0085-04

10.7506/spkx1002-6630-201408016

2013-07-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100807）

吳亞君（1975—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺锓N鑒定技術(shù)。E-mail：wuyajuncaiq@163.com*

陳穎（1972—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称肺锓N鑒定技術(shù)。E-mail：chenyingcaiq@163.com