許國晶 繩秀珍 戰(zhàn)文斌

(中國海洋大學(xué)教育部海水養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青島 266003)

多聚免疫球蛋白受體(polymeric immunoglobulin receptor,pIgR)是主要組織相容性復(fù)合物(MHC)家族中的重要成員,是由黏膜上皮細(xì)胞合成的一種多肽,通常與分泌型多聚免疫球蛋白(IgA或 IgM)形成復(fù)合物,有時也以游離型存在(張春剛等,2008)。哺乳動物中,在黏膜局部占主導(dǎo)作用的免疫球蛋白是 IgA,pIgR可以與多聚IgA或IgM結(jié)合,介導(dǎo)多聚免疫球蛋白尤其是多聚IgA的跨上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌,發(fā)揮IgA 在黏膜屏障中局部清除病原體和毒素的作用。硬骨魚的皮膚及腸道和哺乳動物的腸道一樣,通過pIgR轉(zhuǎn)運(yùn)IgM或IgT進(jìn)入黏膜中,這為魚類粘膜免疫系統(tǒng)的特異性免疫提供了有力證據(jù)(Hamuroet al,2007;Zhanget al,2010)。

在硬骨魚中,有關(guān)河豚(Takifugu rubripes)、鯉魚(Cyprinus carpio)、斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、大西洋鮭魚(Salmo salar)pIgR的研究已有報道(Hamuroet al,2007;Romboutet al,2008;Fenget al,2009;Zhanget al,2010;Tadisoet al,2011);GenBank中可查到斑馬魚(Danio rerio)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)pIgR氨基酸序列。哺乳動物的pIgR包含5個免疫球蛋白樣功能域(Ig-like domain,D1—D5),鳥類和兩棲類pIgR含有4個免疫球蛋白樣功能域(Wielandet al,2004;Braathenet al,2007),而硬骨魚類pIgR僅包含2個對應(yīng)于哺乳動物D1和D5的免疫球蛋白樣功能域(Hamuroet al,2007;Romboutet al,2008)。但是,這種小分子量pIgR可以結(jié)合硬骨魚類 IgM,并且 pIgR基因在魚皮膚上皮細(xì)胞、腸和肝細(xì)胞等有較高的表達(dá)水平(Hamuroet al,2007)。

pIgR作為重要的黏膜免疫系統(tǒng)的受體分子,由其介導(dǎo)的分泌型抗體的轉(zhuǎn)運(yùn)過程在生物體抵御病原體的粘附、入侵過程中起著相當(dāng)重要的作用,是多聚免疫球蛋白發(fā)揮黏膜防御功能的必要條件。魚類pIgR的研究不僅為魚類 Ig的轉(zhuǎn)運(yùn)提供直接證據(jù),而且在魚類養(yǎng)殖中具有一定的應(yīng)用潛力(Hamuroet al,2007)。牙鲆(Paralichthys olivaceus)作為我國傳統(tǒng)的名貴商品魚和出口創(chuàng)匯重要養(yǎng)殖品種之一,到目前為止尚未見關(guān)于其 pIgR的研究報道。本文擬通過PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得牙鲆 pIgR基因全長開放閱讀框(ORF),研究 pIgR基因在大腸桿菌中的表達(dá),通過SDS-PAGE、western-blot及ELISA對pIgR基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證,為進(jìn)一步研究pIgR的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及深入了解其在粘膜免疫防御中的作用機(jī)理提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

健康牙鲆購自山東膠南牙鲆魚養(yǎng)殖場,平均體長20cm,平均體重30g。于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)80cm×50cm×40cm的玻璃鋼水槽中暫養(yǎng),水溫(20 ± 0.5)°C,連續(xù)充氣,每日換水一次,換水量1/3—1/2,暫養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自Transgen公司;pET-32(a)表達(dá)載體及表達(dá)菌株Escherichia coli(E.coli)BL21(DE3)購自Novagen公司;PMD18-T載體、DNA聚合酶、限制酶EcoRI和NotI、T4DNA連接酶、DNA凝膠純化試劑盒購自TaKaRa公司;IPTG購自INALCO公司;質(zhì)粒抽提試劑盒和凝膠回收試劑盒購自寶生物;AP標(biāo)記羊抗小鼠抗體購于SIGMA公司;鼠抗His-tag單克隆抗體購自北京華大蛋白公司。

鼠抗牙鲆血清免疫球蛋白的單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備(Liet al,2007),牙鲆IgM參照Liet al(2007)的硫酸銨鹽析和離子交換柱層析法進(jìn)行純化。

1.2 牙鲆pIgR開放閱讀框cDNA的克隆

根據(jù)牙鲆pIgR(GenBank:HM536144)開放閱讀框cDNA序列和表達(dá)載體pET-32(a)的多克隆位點(diǎn)序列,設(shè)計(jì)了一對特異引物,由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。為便于基因的克隆及構(gòu)建表達(dá)載體等后續(xù)工作,在引物中引入了EcoRI和NotI 的酶切位點(diǎn)(劃線表示)。pIgR-1:5′-CCGGAATTC ATGGCGCAACTCT TCACACTC-3′;pIgR-2:5′-TTTTCCTTTTGCGGCCG CTCAGTGCATAAAAACATCCTG-3′。從牙鲆肝臟中提取總RNA,通過RT-PCR合成第一鏈和進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min,30個循環(huán)擴(kuò)增(94°C,50s;58°C,50s;72°C,90s),72°C延長10min。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α,抗生素和菌落PCR篩選重組子,測序。

1.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以EcoRI和NotI分別雙酶切pET-32(a)和序列正確的pMD18-T-pIgR質(zhì)粒DNA,切膠回收純化后,以T4DNA Ligase連接片段,構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32(a)-pIgR,轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達(dá)菌株E.coliBL21(DE3),菌落PCR篩選重組子,并小量制備質(zhì)粒DNA,以EcoRI和NotI對產(chǎn)物雙酶切篩選和鑒定陽性重組質(zhì)粒。

1.4 pIgR重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性重組菌BL21的單菌落接種至4mL LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL AMP),37°C振蕩培養(yǎng)過夜,次日以10%的接種量轉(zhuǎn)入5mL 的LB培養(yǎng)基中(含100μg/mL AMP),培養(yǎng)至A600約0.6時,加入IPTG(終濃度為1mg/mL)進(jìn)行誘導(dǎo),繼續(xù)培養(yǎng)10 h,每隔2 h取1mL菌液作為檢測樣品,利用SDS-PAGE確定最佳誘導(dǎo)時間。大量誘導(dǎo)菌液100mL,6000g離心10min收集菌體,用PBS重懸后超聲破碎4min(Sonics &Materials;振幅39%;pulse on,3s;pulse off,3s),6000g離心收集沉淀,以SDS-PAGE鑒定表達(dá)結(jié)果。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化

收集經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的細(xì)菌培養(yǎng)物,6000g離心10min;用緩沖液 A(50mmol/L;Tris-HCl,2mmol/L EDTA,100mmol/L NaCl,pH 8.0)6000g離心洗滌2次,每次 10min;將菌體細(xì)胞用緩沖液 B(50mmol/L Tris-HCl,1mmol/L EDTA,100mmol/L NaCl,1%NP-40,pH 8.0)重懸,反復(fù)凍融 5次后將菌液分裝于10mL離心管,每管 6mL,然后于冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎8min(Sonics &Materials;振幅39%;pulse on,4s;pulse off,1s),1500g離心30min收集包涵體沉淀;親和層析進(jìn)一步純化重組蛋白:以 Ni離子螯合的親和層析柱(HisTrap HP 1mL,GE)對重組蛋白進(jìn)行純化,以binding buffer(20mmol/L Na3PO4,0.5mol/L NaCl,30mmol/L咪唑,8mol/L尿素,pH 7.4)溶解收集的包涵體,經(jīng)0.45 μm的濾膜過濾后向親和層析柱中加入樣品,經(jīng) binding buffer平衡后,以 elution buffer(20mmol/L Na3PO4,0.5mol/L NaCl,500mmol/L咪唑,8mol/L尿素,pH 7.4)洗脫目的蛋白,洗脫產(chǎn)物經(jīng)尿素濃度梯度透析后,最后以PBS進(jìn)行透析品;透析完成后對樣品進(jìn)行冷凍干燥以濃縮樣品,一部分通過SDS-PAGE檢測純化情況,其它用PBS重懸–80°C保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組蛋白的western-blot分析

取誘導(dǎo)后的菌體進(jìn)行SDS-PAGE,以未經(jīng)誘導(dǎo)的菌體為對照,純化后的重組蛋白pIgR為陽性對照。Mini Trans-Blot Transfer Cell(Bio-Rad)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(恒壓30 V轉(zhuǎn)移2 h),以封閉液(0.01mol/L pH 7.4的PBS,含5%脫脂奶粉)封閉過夜,加鼠抗His-tag單克隆抗體,37°C反應(yīng)1 h,PBST洗3次;再加AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,1︰5000稀釋,37°C反應(yīng)1 h,PBST洗3次后,放入新鮮配制的NBT/BCIP發(fā)色液中,室溫顯色30min后水洗終止反應(yīng)。

1.7 ELISA檢測重組蛋白與IgM的結(jié)合

以純化的牙鲆 pIgR重組表達(dá)蛋白包被酶標(biāo)板,每孔 100μL,包被過夜;然后每孔加入 200μL 含4%BSA的PBS,37°C封閉1h,PBST洗滌3次后,加入純化的牙鲆IgM孵育4h;同上洗滌3次后,加入鼠抗牙鲆血清Ig單克隆抗體,37°C孵育1h;再加AP標(biāo)記的羊抗鼠IgG,1︰5000稀釋,37°C反應(yīng)1h,PBST洗3次后,加入PNPP顯色液100μL,暗處反應(yīng)15min,以2mol/L H2SO4終止顯色,用酶標(biāo)儀檢測各孔405nm波長處的OD值,檢測孔與陰性對照的OD值比值大于2為陽性。以包被His標(biāo)簽蛋白代替牙鲆pIgR重組表達(dá)蛋白作為陰性對照;另外,以PBS代替純化的牙鲆IgM作為陰性對照。

2 結(jié)果

2.1 牙鲆pIgR基因開放閱讀框的克隆

以牙鲆肝臟的總 RNA作模板,RT-PCR結(jié)果顯示,在1005bp處擴(kuò)增出特異性條帶(圖1)。測序結(jié)果表明,pIgR開放閱讀框cDNA與報道的牙鲆pIgR開放閱讀框 cDNA序列(GenBank:HM536144)有兩個堿基差異,但推斷的氨基酸序列完全一致,所以可以用于表達(dá)。

圖1 牙鲆pIgR開放閱讀框PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR product of pIgR ORF gene

2.2 表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選

以EcoRI和NotI雙酶切含有 pIgR基因的pMD18-T,回收目的基因片段,插入 pET-32(a)載體的相同酶切位點(diǎn)得到重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-32(a)-pIgR,轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,得到重組菌BL21(DE3)/pET-32(a)-pIgR。在轉(zhuǎn)化平板上隨機(jī)挑取10個菌落進(jìn)行菌落 PCR檢測,結(jié)果均為陽性,選取其中1個進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),收集培養(yǎng)菌后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒,利用EcoRI和NotI進(jìn)行酶切,將酶切產(chǎn)物和酶切前的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果表明質(zhì)粒經(jīng)過酶切后,得到一條分子量在 1005bp左右的基因條帶,與表達(dá)的目的基因相符(圖2)。

圖2 表達(dá)載體pET32a-pIgR的雙酶切檢測Fig.2 Double-enzyme digestion of recombitant pET32a-pIgR

2.3 重組牙鲆pIgR的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及SDS-PAGE分析

分別取IPTG誘導(dǎo)0h,2h,4h,6h,8h及10h后的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng) SDS-PAGE,結(jié)果顯示,與未經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌相比,誘導(dǎo)后的重組質(zhì)粒pET-32(a)- pIgR的細(xì)胞裂解液在58kDa處有一條特異性蛋白條帶,目的基因編碼335個氨基酸,表達(dá)的蛋白片段理論分子量為 37kDa,質(zhì)粒 pET-32(a)的標(biāo)簽蛋白大小則約為21kDa左右,結(jié)果與理論大小相符,并且 IPTG誘導(dǎo)6h后蛋白表達(dá)量趨于穩(wěn)定(圖3)。在優(yōu)化表達(dá)條件后,將經(jīng) IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 6h的細(xì)菌裂解液及表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析純化后的最終產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE,電泳結(jié)果顯示獲得了純度很高的目的表達(dá)蛋白,無其它明顯雜帶存在(圖4)。

2.4 重組蛋白pIgR的western-blot分析

Western-blot結(jié)果顯示陽性對照及重組菌株在58kDa處均有一條明顯的特異條帶(圖5),而陰性對照即未經(jīng)誘導(dǎo)的菌株沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶(圖5),表明重組蛋白可與鼠抗His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),與預(yù)期結(jié)果一致。

2.5 ELISA檢測重組pIgR與IgM的結(jié)合

應(yīng)用抗血清Ig抗體,通過ELISA檢測牙鲆pIgR重組表達(dá)蛋白與 IgM 的結(jié)合活性,結(jié)果在檢測孔405nm處的OD值達(dá)0.5790,與陰性對照孔的OD值(His標(biāo)簽蛋白:O.D.=0.0911;PBS:O.D.=0.0787)比值明顯大于2,說明重組pIgR與IgM發(fā)生了特異性結(jié)合(圖6)。

圖3 重組蛋白pIgR的誘導(dǎo)時間分析Fig.3 Effect of induction time on the expression of recombinant pIgR

圖4 重組蛋白pIgR的純化Fig.4 The purification of the recombinant pIgR

圖5 重組蛋白pIgR的 western blot 分析Fig.5 Western blot of the recombinant pIgR

圖6 ELISA檢測pIgR與IgM的結(jié)合Fig.6 Detection of the binding of pIgR to IgM in vitro by ELISA

3 討論

全基因組序列分析顯示,牙鲆pIgR ORF基因片段全長1005bp,編碼335個氨基酸殘基(GenBank:HM536144)。本文通過PCR技術(shù),擴(kuò)增pIgR ORF基因片段為1005bp,有兩個堿基差異,但推斷的氨基酸序列完全一致,可以用于表達(dá)。大腸桿菌表達(dá)重組蛋白時常常形成包涵體,而對包涵體的變性、復(fù)性等操作會影響重組蛋白生物活性。因此,在構(gòu)建表達(dá)載體時,將pIgR基因與表達(dá)載體pET-32(a)中N端的6×His-tag進(jìn)行融合表達(dá),便于后續(xù)對重組蛋白進(jìn)行表達(dá)分析和分離純化等。重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)時,6×His-tag與外源插入片段共同表達(dá),因而融合蛋白帶有6×His-tag。在大多數(shù)情況下,6×His-tag不影響重組蛋白的結(jié)構(gòu)和功能,可以利用該蛋白標(biāo)簽通過Ni-NTA柱純化便于融合蛋白的純化(劉臻等,2010)。本文構(gòu)建的牙鲆pIgR ORF表達(dá)載體pET-32(a)-pIgR轉(zhuǎn)化表達(dá)受體菌后,經(jīng)IPTG 37°C誘導(dǎo)6h 實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá),獲得分子量大小為58 kDa的融合蛋白,與推測的理論產(chǎn)物大小一致,說明牙鲆pIgR ORF能夠在BL21(DE3)大腸桿菌中成功表達(dá)。6×His-tag標(biāo)簽序列蛋白大小為21kDa,因此得出目的蛋白大小為37kDa,分子量與虹鱒pIgR表達(dá)蛋白38 kDa接近(Zhanget al,2010),大于斑馬魚pIgR原核表達(dá)蛋白30.75 kDa(王輝,2007)、鯉魚pIgR原核表達(dá)蛋白29kDa(王磊,2009),及斜帶石斑魚pIgR原核表達(dá)蛋白28kDa(馮麗娜,2009),但整體相差不大。經(jīng)過蛋白分析發(fā)現(xiàn),牙鲆pIgR具有與斑馬魚、鯉魚、虹鱒、河豚及斜帶石斑魚相同的結(jié)構(gòu),都具有信號肽,2個免疫球蛋白功能域,一段跨膜區(qū)以及胞內(nèi)區(qū)(pIgR基因序列及結(jié)構(gòu)特征數(shù)據(jù)另文發(fā)表)。為進(jìn)一步鑒定該表達(dá)系是否能正確表達(dá)目的蛋白,本文以未轉(zhuǎn)染pET-32(a)-pIgR的E.coliBL21(DE3)作為對照,應(yīng)用Western-blot驗(yàn)證重組蛋白可與鼠抗His-tag單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng),證明了重組蛋白表達(dá)的正確性。

哺乳動物黏膜表面的pIgR在體液免疫中發(fā)揮重要作用,位于黏膜下的IgA與穿過表皮屏障的抗原結(jié)合,通過pIgR介導(dǎo)的運(yùn)送機(jī)制,將抗原排出體外,或通過類似方式,阻斷細(xì)胞內(nèi)病毒的合成和組裝(張春剛等,2008)。本研究構(gòu)建的牙鲆pIgR ORF片段包括胞外區(qū)2個免疫球蛋白功能域,即配體結(jié)合區(qū),具有結(jié)合Ig功能(Hamuroet al,2007)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組牙鲆pIgR具有結(jié)合Ig的活性,本文在純化pIgR表達(dá)蛋白的過程中,首先將變性條件下的蛋白進(jìn)行了透析,梯度降低了尿素的濃度,從而使變性的蛋白能夠緩慢復(fù)性,甚至?xí)謴?fù)到天然構(gòu)象,從而更好的模擬天然狀態(tài)的pIgR。本研究通過ELISA方法應(yīng)用抗血清Ig單克隆抗體研究純化的重組pIgR與IgM的結(jié)合關(guān)系,發(fā)現(xiàn)牙鲆pIgR重組表達(dá)蛋白具有IgM結(jié)合活性。這與Hamuro等(2007)、Feng等(2009)及Zhang等(2010)的研究結(jié)果一致。在河豚中,Hamuro等(2007)通過非變性電泳發(fā)現(xiàn)IgM與pIgR復(fù)合物;Feng等(2009)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)斜帶石斑魚重組pIgR具有結(jié)合Ig的能力;Zhang等(2010)也在虹鱒腸黏液中發(fā)現(xiàn)了IgT與pIgR復(fù)合物,說明pIgR與Ig的轉(zhuǎn)運(yùn)存在密切聯(lián)系。

本文通過PCR技術(shù)克隆了牙鲆pIgR基因,進(jìn)行原核表達(dá),并通過western-blot和 ELISA方法,初步驗(yàn)證了pIgR基因的功能。作者后續(xù)將應(yīng)用純化的重組pIgR,制備抗血清及單克隆抗體,通過免疫熒光及免疫組化等技術(shù)分析牙鲆pIgR在黏膜免疫系統(tǒng)中的分布,通過免疫印跡技術(shù)等分析pIgR與Ig的結(jié)合位點(diǎn),為深入研究pIgR的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制及了解pIgR在黏膜免疫防御中的作用機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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