劉 群 黃 倢 楊昊霖 楊 冰 劉 筍王海亮 王勤濤 劉 飛 張慶利

(1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071;2.上海海洋大學(xué) 上海 201306)

2010年以來,越南和我國海南養(yǎng)殖的凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)相繼出現(xiàn)不明原因的疫病,并導(dǎo)致了較高的對(duì)蝦死亡率,對(duì)越南對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成了毀滅性打擊。2011年在馬來西亞發(fā)現(xiàn)該疫病,2012年泰國也出現(xiàn)流行。因該不明疾病最初的表現(xiàn)是,養(yǎng)成期投苗30d左右后的對(duì)蝦出現(xiàn)不尋常的高死亡率,因此被稱為早期死亡綜合征(early mortality syndrome,EMS)。2012年8月,亞太水產(chǎn)養(yǎng)殖中心網(wǎng)絡(luò)(NACA)針對(duì)此次突發(fā)的對(duì)蝦疾病,召集全球知名對(duì)蝦病害專家在泰國召開緊急咨詢會(huì),確定該疫病已感染的對(duì)蝦種類包括凡納濱對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)、中國明對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)等,表觀癥狀為肝胰腺蒼白、萎縮,軟殼,胃腸空或內(nèi)容物不連續(xù),放苗后最早10d就能發(fā)病死亡,瀕死蝦不常出現(xiàn)在池邊或水面,而是沉入池底;組織病理學(xué)表現(xiàn)為對(duì)蝦肝胰腺盲管從中段到末端進(jìn)行性變性,B、F和R細(xì)胞功能紊亂,部分細(xì)胞核膨大,肝胰腺盲管上皮細(xì)胞壞死或脫落,在后期肝胰腺盲管間或盲管內(nèi)血細(xì)胞浸潤,肝胰腺被細(xì)菌二次感染,因此該疫病被定義為急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS),但在該會(huì)上以及至今國際上尚未能確定該疫病是由某種特定病原引起還是由毒素所致(NACA,2012)。

黃頭病毒(yellow-head virus,YHV)屬于頭甲病毒屬(Okavirus),桿套病毒科(Roniviridae),套式病毒目(Nidovirales)(Cowleyet al,2012),于1990年首次在泰國養(yǎng)殖斑節(jié)對(duì)蝦中被發(fā)現(xiàn),YHV基因型1所引起的黃頭病(Yellow head disease,YHD)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(World Organization for Animal Health,OIE)水生動(dòng)物疫病名錄收錄,引起斑節(jié)對(duì)蝦(Chantanachookinet al,1993)、凡納濱對(duì)蝦(Sittidilokratnaet al,2009)等大量死亡。此前在我國養(yǎng)殖對(duì)蝦中沒有檢出過,也沒有針對(duì)中國明對(duì)蝦宿主的相關(guān)報(bào)道。本研究在我國發(fā)生疑似AHPNS的凡納濱對(duì)蝦及中國明對(duì)蝦樣品中檢測(cè)到Y(jié)HV的新基因型毒株,為揭示AHPNS的病原提供了重要信息,也表明我國對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)已面臨了新的疫病威脅,值得高度關(guān)注。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2012年 6月自河北某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)采集發(fā)病中國明對(duì)蝦成蝦,對(duì)蝦大小8—10cm;2013年1月自福建某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)采集發(fā)病凡納濱對(duì)蝦幼蝦,個(gè)體大小4—5cm;2013年3月自廣東某對(duì)蝦育苗場(chǎng)采集凡納濱對(duì)蝦親蝦,個(gè)體大小 16—18cm。采集的河北對(duì)蝦新鮮樣品保存于-80°C,留作RNA提取用,而另外兩地對(duì)蝦肝胰腺樣品使用RNAlater(Qiagen)保存于1.5mL RNase-free離心管,留作提取RNA使用,三地對(duì)蝦樣品均取頭胸部,用 Davidson’s AFA 固定液固定 24h,換75%乙醇長期保存,組織留作組織病理切片使用。

1.2 組織病理切片制作

Davidson’s AFA 固定液固定的對(duì)蝦樣品進(jìn)行石蠟組織切片和蘇木精-伊紅染色(Bell,1988),封片后,于光學(xué)顯微鏡(Nikon E800,日本)下觀察結(jié)果。

1.3 RNA的提取

從 RNAlater保存的樣品上切取一小塊于RNase-free水中10min后,放入800μL TRIzol Reagent(Invitrogen)中;冰凍樣品切取小塊后直接放入 800μL TRIzol Reagent(Invitrogen)中。使用RNase-free研磨棒對(duì)樣品進(jìn)行組織研磨,研磨后向其中加入160μL氯仿,振蕩混勻后室溫靜置15min,4°C,12000rpm離心15min;取上層水相,加入等體積冰浴異丙醇,混勻后室溫放置5min,4°C,12000rpm離心10min,沉淀加入1mL冰浴75%乙醇小心混勻,室溫靜置5min,4°C,12000rpm 離心 5min,沉淀晾干,加入 50μL RNasefree水溶解,并經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀(NANO Drop 2000,USA)測(cè)定其濃度與純度,置于-80°C保存。

1.4 YHV的套式RT-PCR

1.4.1 cDNA的合成 參考《Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals》(OIE,2012)推薦的關(guān)于YHV的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法進(jìn)行樣品檢測(cè),同時(shí)設(shè)置凡納濱對(duì)蝦 β-actin基因作為內(nèi)參對(duì)照。所使用的引物的目標(biāo)基因?yàn)閅HV-PmA replicase polyprotein 1ab gene(EU977578),序列見表1。

取 2μL RNA,加入引物 Y1 和 Y2(50μmol/L)各0.7μL、2.6μL RNase-free H2O,混勻后離心,70°C 反應(yīng) 10min后,向體系中加入 2μL 5×MMLV Buffer、1μL RNase inhibitor(40U/uL,TaKaRa)、 0.5μL dNTP(10mmol/L),42°C預(yù)熱2min,加入0.5μL MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/μL,TaKaRa),42°C 保溫 1h,70°C 反應(yīng)10min。以此合成的cDNA作為檢測(cè)YHV用模板。

于此同時(shí),按照 Prime Script?1ststrand cDNA synthesis Kit(TaKaRa)說明書進(jìn)行基因組cDNA的合成,將逆轉(zhuǎn)錄樣品預(yù)混置于65°C 5min后,冰上淬冷,配制逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)液,緩慢混勻,30°C 10min,42°C 1h,95°C 5min。以此合成的cDNA作為設(shè)置內(nèi)參對(duì)照用模板。

表1 用于PCR擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Primers sequences for PCR amplification

1.4.2 第 1步 PCR 在 PCR 管中加入 2.5μL 10×Taq PCR Buffer(Mg2+free,TaKaRa)、1.5μL MgCl2(25mmol/L)、0.5μL dNTP(10mmol/L)、引物 Y1 和 Y2(50μmol/L)各 0.35μL、0.25μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、19.05μL RNase-free H2O,85°C 預(yù)熱 3min 后,加入 0.5μL cDNA,擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C 30s、66°C 30s、72°C 45s,35 個(gè)循環(huán);72°C 7min,4°C 保溫。

1.4.3 第 2步 PCR 在 PCR 管中加入 2.5μL 10×Taq PCR Buffer(Mg2+free,TaKaRa)、1.5μL MgCl2(25mmol/L)、0.5μL dNTP(10mmol/L)、引物 Y2 和 Y3(50μmol/L)各 0.35μL、0.25μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、18.55μL RNase-free H2O,85°C 預(yù)熱 3min 后,加入 1μL第 1步 PCR反應(yīng)產(chǎn)物,擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95°C 30s、66°C 30s、72°C 45s,35 個(gè)循環(huán);72°C 7min,4°C保溫。并對(duì)兩步PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠成像儀(培清)進(jìn)行照相。

1.5 三地樣品的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

采用 YHV快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒(張慶利等,2011)的改進(jìn)型號(hào)(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所海水養(yǎng)殖生物疾病控制與分子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室),分別對(duì)來自三地的樣品所提取的RNA按試劑盒說明書進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)蝦癥狀

在河北某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病池邊的淺水區(qū)不容易看到瀕死蝦,通過撒網(wǎng)撈取發(fā)病的中國對(duì)蝦,觀察對(duì)蝦發(fā)病癥狀,與正常對(duì)蝦相比,發(fā)現(xiàn)對(duì)蝦肝胰腺區(qū)域顏色變淺發(fā)黃,部分對(duì)蝦肝胰腺明顯萎縮,空胃,空腸,腸道略微腫脹,腹節(jié)肌肉輕微渾濁。在福建某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)池邊撈取的發(fā)病凡納濱對(duì)蝦通體白濁,甲殼軟,與肉之間有分離感,肝胰腺顏色淺。在廣東某對(duì)蝦育苗場(chǎng)發(fā)現(xiàn)凡納濱對(duì)蝦親蝦肝胰腺顏色淺,部分出現(xiàn)萎縮,空腸空胃,腹節(jié)肌肉輕微渾濁,部分對(duì)蝦呈現(xiàn)黑鰓或黃鰓。

2.2 病理組織切片

河北某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)樣品的肝胰腺盲管間以及肝胰腺區(qū)域中腸上皮血淋巴細(xì)胞浸潤,部分盲管完全被細(xì)菌感染,并被大量血淋巴細(xì)胞包裹形成結(jié)節(jié)(圖1a),肝胰腺盲管上皮的B、R和F細(xì)胞消失,部分上皮細(xì)胞核腫大(圖1b),中腸和肝胰腺浸潤的血淋巴細(xì)胞以及淋巴器官中可觀察到較多的核固縮、破裂和嗜堿性細(xì)胞質(zhì)包涵體(圖1c)。福建對(duì)蝦樣品的肝胰腺組織盲管間存在血細(xì)胞浸潤,部分肝胰腺盲管上皮細(xì)胞層萎縮變薄(圖1d),肝胰腺盲管上皮的B、R和F細(xì)胞消失,部分細(xì)胞核腫大,并存在細(xì)胞核仁膨大形成包涵體樣(圖1e、圖1f)。在廣東對(duì)蝦樣品的肝胰腺盲管間也觀察到血淋巴細(xì)胞浸潤(圖1g),肝胰腺盲管上皮的B、R和F細(xì)胞消失(圖1g、圖1h),部分細(xì)胞核腫大(圖1h),肝胰腺盲管上皮層萎縮,與盲管膜分離(圖1g、圖1i)。

2.3 套式PCR檢測(cè)結(jié)果

采用OIE手冊(cè)推薦的YHV檢測(cè)的套式PCR方法,檢測(cè)來自河北、廣東、福建的對(duì)蝦樣品(圖2),第1步 PCR反應(yīng)結(jié)果表明,來自河北對(duì)蝦樣品可得到794bp目的條帶,而其余兩地來源對(duì)蝦樣品在第1步PCR后未能得到此目的條帶;第1步PCR反應(yīng)后,三地樣品均可擴(kuò)增得到277bp目的條帶。

2.4 三地樣品中未知病原與YHV/鰓聯(lián)病毒(GAV)的同源性及其系統(tǒng)發(fā)育分析

將以上目的產(chǎn)物測(cè)序,經(jīng)NCBI BLAST后(表2)可以看出,河北疑患 AHPNS樣品的 YHV檢測(cè)第 1步PCR反應(yīng)產(chǎn)物的引物間的748bp目的條帶的序列(YHV_AHPNS_hb2012,KF278563)與 YHV 1992(FJ848673.1)相應(yīng)區(qū)段的相似性為 87%;河北(YHV_AHPNS_hb2012,KF278563)、福建(YHV_AHPNS_fj2013,KF278564)及廣東(YHV_AHPNS_gd2013,KF278565)疑患 AHPNS樣品中的 YHV檢測(cè)第 2步PCR反應(yīng)產(chǎn)物的引物間的 229bp目的條帶的序列與YHV1995(FJ848674.1)的相應(yīng)區(qū)段的相似性分別為89%、86.4%和76.5%。

由第1步PCR產(chǎn)物序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,YHV_AHPNS_hb2012(KF278563)與 YHV(EU487200)、YHV 1995(FJ848674)、YHV-PmA(EU977578)、YHV 1992(FJ848673)、YHV(FJ627274)、YHV 1999(FJ848675)等 6株 YHV 一起首先從 GAV(NC_010306)和 YHV type4(EU170438)親緣關(guān)系中分離出來,位于一條主分支。但在這一主分支上,YHV_AHPNS_hb2012(KF278563)明顯與6株YHV表現(xiàn)出較遠(yuǎn)的分離關(guān)系(圖3a)。

由第2步PCR產(chǎn)物序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹總體維持了上述關(guān)系,三地來源的YHV屬同一次分支,但在這3株之間,YHV_AHPNS_hb2012(KF278563)與YHV_AHPNS_fj2013(KF278564)親緣關(guān)系較近,而 YHV_AHPNS_gd2013(KF278565)又有較遠(yuǎn)的延伸(圖3b)。

圖1 肝胰腺病理組織觀察Fig.1 Pathologic histology diagnosis in hepatopancreas

圖2 套式PCR檢測(cè)YHV結(jié)果Fig.2 Result of detecting YHV(yellow-head virus)by nested-PCR

表2 三地來源的YHV檢測(cè)產(chǎn)物序列與YHV1992、YHV1995對(duì)應(yīng)序列的比對(duì)Tab.2 Alignment between the sequences of the products of YHV(yellow-head virus)detections and those of YHV1992 and YHV 1995

圖3 疑患AHPNS對(duì)蝦檢出的YHV陽性片段序列與YHV/GAV相應(yīng)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the PCR products of the shrimp suspicious of suffering from AHPNS and the relevant sequences of YHV/GAV(gill-associated virus)

圖4 三地樣品YHV快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Results of highly sensitive and rapid detection kit for YHV with the samples from three locations

2.5 三地樣品的快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

三地樣品提取的RNA用YHV快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行80min的LAMP反應(yīng)檢測(cè)后顯色,陽性對(duì)照顏色顯示為強(qiáng)綠色,陰性對(duì)照顏色顯示為橙黃色,表明試劑盒檢測(cè)正常結(jié)果有效。三個(gè)地區(qū)取樣的樣品的 RNA經(jīng)檢測(cè),結(jié)果全部顯示強(qiáng)綠色,均為YHV強(qiáng)陽性。

3 討論

YHD是 OIE收錄的甲殼動(dòng)物疫病,我國將其列為二類動(dòng)物疫病。YHV基因型1是黃頭病毒群的已知 6個(gè)基因型之一,也是黃頭病的唯一病原(OIE,2012),GAV是黃頭病毒群的基因型2,GAV和其他4個(gè)基因型(基因型3—6)通常只在東非、亞洲和澳大利亞養(yǎng)殖的健康斑節(jié)對(duì)蝦中出現(xiàn),很少與疫病相關(guān)(Walkeret al,2001;Wijegoonawardaneet al,2008;Wijegoonawardaneet al,2009)。經(jīng)我們多年的流行病學(xué)監(jiān)測(cè),從未在我國養(yǎng)殖的對(duì)蝦中檢出過 YHV,從我國各地的水生動(dòng)物流行病學(xué)監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)中也從未發(fā)現(xiàn)我國有發(fā)生 YHD的情況,我國 2005年曾報(bào)道過YHV的檢出,該樣品是泰國入境的斑節(jié)對(duì)蝦(熊煒等,2006)。本文采用 OIE標(biāo)準(zhǔn),從我國養(yǎng)殖對(duì)蝦中檢測(cè)到 YHV的陽性,是我國養(yǎng)殖的對(duì)蝦樣品中首次檢出YHV的存在。這一結(jié)果得到確認(rèn)后,我們立即向農(nóng)業(yè)部作了報(bào)告,隨后,我國于 2012年底向 OIE通報(bào)了該疫病在我國的存在。

2010年以來,新發(fā)生的 EMS/AHPNS給對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴(yán)重?fù)p失,在國際上引起了廣泛關(guān)注,雖然國際上對(duì)這一疫病的病癥和病理特征給出了明確的定義,但該疫病的病原病因一直沒有明確結(jié)論(Flegel,2012;Leanoet al,2012;Lightneret al,2012;NACA,2012),使疫病防控?zé)o從下手。本文觀察到的癥狀與NACA對(duì)AHPNS的癥狀定義相符,且組織病理學(xué)特征也符合 AHPNS的組織病理學(xué)定義(NACA,2012),表明這些對(duì)蝦確實(shí)罹患 AHPNS,在這些患病對(duì)蝦中均一致檢出我國從未檢出過的 YHV新毒株,即引起AHPNS的病原可能是這一新基因型的YHV。

國際上有觀點(diǎn)認(rèn)為 AHPNS最早于2009年在中國南方發(fā)生(Flegel,2012;Leanoet al,2012)。我們?cè)?009年的流行病學(xué)調(diào)查中采集到與AHPNS相似的凡納濱對(duì)蝦“偷死病”樣品,但對(duì)所采集的樣品的組織病理學(xué)與AHPNS病理學(xué)特征不符,其發(fā)病癥狀也有所差異,“偷死病”與AHPNS可能是2種不同病害(Huang,2012)。2010年越南對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)遭受了 AHPNS的嚴(yán)重打擊,而我國當(dāng)年對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量并沒有如越南那樣受到嚴(yán)重影響,目前并沒有確切的證據(jù)表明該病最早發(fā)生于我國。我國養(yǎng)殖對(duì)蝦在此之前從未檢出過YHV,該疫病病原得到確認(rèn)以后,這一疫病的真正源頭也將有可能逐步得以揭示。

在AHPNS的病因分析中,國內(nèi)外學(xué)者都進(jìn)行了多種病原的篩查,白斑綜合征病毒(WSSV)等病原在很多檢測(cè)中都表現(xiàn)出與該疫病不相關(guān)(Flegel,2012;Huang,2012;Lightneret al.2012),雖然從患病對(duì)蝦中分離到了有致病力的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等細(xì)菌性病原(張寶存等,2012),但病理學(xué)和人工感染研究表明細(xì)菌的感染應(yīng)該是繼發(fā)感染(Flegel,2012;Lightneret al,2012;NACA,2012),我們的前期調(diào)查和國外研究者也排除了YHV感染的可能(Flegel,2012;Huang,2012;NACA,2012)。但本文研究結(jié)果顯示,新檢測(cè)到的 YHV遺傳差異介于YHV致病1型與非致病4型之間,與已報(bào)道的YHV存在明顯的差異,所測(cè)的基因片段的相似性在 90%以下,且對(duì)蝦肝胰腺呈現(xiàn)與患AHPNS對(duì)蝦相似的病理。用OIE手冊(cè)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)時(shí),只有河北來源的樣品在套式 RT-PCR的第 1步反應(yīng)中得出目的產(chǎn)物,而福建和廣東樣品都只在套式的第2步擴(kuò)增中得到微弱的產(chǎn)物條帶,基因序列分析表明樣品間存在明顯的YHV變異,這符合 RNA病毒變異的特點(diǎn),可能也導(dǎo)致 OIE標(biāo)準(zhǔn)方法靈敏度低,甚至檢測(cè)不到,更多的序列分析和分子流行病學(xué)調(diào)查將最終揭示這個(gè)猜測(cè)。

YHV現(xiàn)場(chǎng)快速高靈敏檢測(cè)試劑盒利用等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了對(duì)特異性對(duì)蝦病毒病的快速、簡(jiǎn)便、高特異性、高靈敏度的檢測(cè),可應(yīng)用于生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)(張慶利等,2011)。試劑盒反應(yīng)的綠色熒光的強(qiáng)弱對(duì)指示病毒量有一定參考價(jià)值,與 OIE標(biāo)準(zhǔn)方法的套式RT-PCR結(jié)果相比,對(duì)這一新的YHV毒株來說,快速高靈敏度檢測(cè)試劑盒更適應(yīng)于靈敏地檢測(cè),這對(duì)于在產(chǎn)業(yè)上更廣泛地確認(rèn) YHV新毒株是否是 AHPNS的病原有重要意義,也將為AHPNS的防控提供關(guān)鍵技術(shù)。

致謝感謝河北、福建、廣東相關(guān)單位及個(gè)人在本文樣品采集方面提供的便利。

張慶利,黃 倢,楊 冰等,2011.對(duì)蝦黃頭病毒現(xiàn)場(chǎng)快速高靈敏檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法.P:ZL 201010147946.2,國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局,2011-07-01

張寶存,劉 飛,邊慧慧等,2012.一株凡納濱對(duì)蝦病原菌的分離、鑒定及其致病力分析.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,33(2):56—62

熊 煒,邱 璐,李 健等,2006.上海檢驗(yàn)檢疫局從泰國進(jìn)境草蝦中檢出蝦黃頭病毒.檢驗(yàn)檢疫科學(xué),16(6):61—63

Bell T A,Lightner D V,1988.A handbook of normal penaeid shrimp histology.Lawrence,Kansas

Chantanachookin C,Boonyaratpalin S,Kasornchandra Jet al,1993.Histology and ultrastructure reveal a new granulosislike virus inPenaeus monodonaffected by yellow-head disease.Dis Aquat Org,17(2):145—157

Cowley J A,Walker P J,Flegel T Wet al,2012.Family Roniviridae.In:Virus Taxonomy,IXth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.King A,ed.Elsevier,Academic Press,London:797—801

Flegel T W,2012.Historic emergence,impact and current status of shrimp pathogens in Asia.J Invert Pathol,110(2):166—173

Huang J,2012.Experiences in EMS/AHPNS from China.In:Report of the Asia Pacific Emergency Regional Consultation on the Emerging Shrimp Disease:Early Mortality Syndrome(EMS)/ Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome(AHPNS),9-10 Aug 2012.Published by the Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific,Bangkok,Thailand.2012:112—117

Leano E M,Mohan C V,2012.Early mortality syndrome threatens Asia’s shrimp farms.Global Aquaculture Advocate,July/August 2012:38—39

Lightner D V,Redman R M,Pantoja C Ret al,2012.Early mortality syndrome affects shrimp in Asia.Global Aquaculture Advocate,2012:40

NACA,2012.Report of the Asia Pacific emergency regional consultation on the emerging shrimp disease:early mortality syndrome(EMS)/ acute hepatopancreatic necrosis syndrome(AHPNS),9-10 Aug 2012.Published by the Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific,Bangkok,Thailand

OIE,2012.Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.World Organisation for Animal Health,http://www.oie.int/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/

Sittidilokratna N,Chotwiwatthanakun C,Wijegoonawardane P K Met al,2009.A virulent isolate of yellow head nidovirus contains a deformed envelope glycoprotein gp116.Virology,384(1):192—200

Walker P J,Cowley J A,Spann K Met al,2001.Yellow head complex viruses:Transmission cycles and topographical distribution in the Asia-Pacific Region.In:The New Wave,Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Culture,Aquaculture 2001,Browdy C.L.&Jory D.E.,ed.The World Aquaculture Society,Baton Rouge,LA,USA:292—302

Wijegoonawardane P K M,Cowley J A,Phan Tet al,2008.Genetic diversity in the yellow head nidovirus complex.Virology,380(2):213—225

Wijegoonawardane P K M,Cowley J A,Sittidilokratna Net al,2009.Homologous genetic recombination in the yellow head complex of nidoviruses infectingPenaeus monodonshrimp.Virology,390(1):79—88