王曉琳，李宏偉，張 競(jìng)，譚正懷（.重慶植恩藥業(yè)有限公司，重慶 400039；.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，成都

610042）

蛻皮甾酮是一類天然產(chǎn)物的統(tǒng)稱，最初在昆蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，是一種具有蛻皮活性的物質(zhì)，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。研究表明，蛻皮甾酮有多種藥理學(xué)作用，如調(diào)節(jié)合成代謝、胃保護(hù)、抗氧化、抑制代謝綜合征、保護(hù)心血管等[1]。相關(guān)研究表明，蛻皮甾酮具有胰島素增敏活性，可通過肝細(xì)胞發(fā)揮非胰島素依賴的降糖作用，但不能刺激胰島素分泌[2]；在胰島素抵抗細(xì)胞模型中能提高胰島素介導(dǎo)的葡萄糖攝取和利用能力，即增加胰島素的敏感性，并能明顯改善糖代謝[3]。后續(xù)研究還證實(shí)，蛻皮甾酮胰島素增敏作用靶點(diǎn)涉及多種與胰島素抵抗相關(guān)的蛋白和激酶[4]。

蛻皮甾酮雖然降糖效果明顯，但其水溶性差，常溫時(shí)幾乎不溶于水，體內(nèi)半衰期很短（僅40 min）。如果做成緩釋片，其半衰期雖然能達(dá)到18 h，但其生物利用度僅為7.8%[5]，不利于成藥。因此，筆者以蛻皮甾酮為基礎(chǔ)進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，篩選得到了一個(gè)水溶性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的新化合物結(jié)構(gòu)蛻皮甾酮衍生物（五元環(huán)磷酸內(nèi)酯衍生物）TAPA。TAPA或其鈉鹽的水中溶解度較蛻皮甾酮分別提高了10倍和50倍，在2×10－7～2×10－9mol/L濃度范圍內(nèi)可使肝癌細(xì)胞HepG2的葡萄糖消耗量增加500%以上，活性較蛻皮甾酮提高30倍以上[6]，這為其進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。本文就TAPA對(duì)2型糖尿病模型大鼠的體內(nèi)降糖作用進(jìn)行研究，進(jìn)一步評(píng)估其成藥性，同時(shí)通過HepG2細(xì)胞模型考察TAPA對(duì)胰島素敏感性和釋放的影響，初步評(píng)估其作用機(jī)制。TAPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 TAPA的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 Chemical structure of TAPA

1 材料

1.1 儀器

7600型全自動(dòng)生化分析儀（日本Hitachi公司）；JPS-3+型手持式快速全血葡萄糖測(cè)試儀（北京怡成生物電子技術(shù)有限公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀（美國(guó)Biorad公司）。

1.2 藥品與試劑

TAPA（白色粉末，重慶植恩藥業(yè)有限公司自制，批號(hào)：100305，純度：98.5%）；羅格列酮鈉片（太極集團(tuán)重慶涪陵制藥廠有限公司，批號(hào)：10070165，規(guī)格：每片4.0 mg）；鏈脲佐菌素（STZ，美國(guó)Sigma公司）；檸檬酸（成都科龍化工試劑廠，批號(hào)：20041102）；檸檬酸鈉（重慶東方試劑廠，批號(hào)：200309）；甘油三酯（TG）試劑盒、總膽固醇（TC）試劑盒（北京北華康泰臨床試劑有限公司，批號(hào)：006304、0709061）；膽固醇（安徽天啟化工科技有限公司出品，批號(hào)：20110106）；豬膽酸鈉（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20081006）；基因工程人胰島素（美國(guó)Lilly公司）；3H-d-葡萄糖（中國(guó)原子能研究院提供）；格列齊特片（哈藥集團(tuán)制藥總廠制劑廠，批號(hào)：20130115，規(guī)格：每片80 mg）。

1.3 動(dòng)物

Wistar大鼠，SPF級(jí)，♀，體質(zhì)量180～200 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK（川）2008-19。

1.4 細(xì)胞

HepG2細(xì)胞和胰島β細(xì)胞瘤細(xì)胞系3（βTC3）細(xì)胞株均由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心細(xì)胞培養(yǎng)室惠贈(zèng)。

2 方法

2.1 TAPA對(duì)2型糖尿病模型大鼠的降糖作用

2.1.1 2型糖尿病模型大鼠的建立。取大鼠100只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n＝10）和高脂組（n＝90）。高脂組給予高脂飼料（含豬油15 g、膽固醇4 g、膽鹽1 g、蛋黃粉5 g、基礎(chǔ)飼料75 g）8周，正常對(duì)照組大鼠給予等量基礎(chǔ)飼料。在給予高脂飼料28 d并禁食不禁水16 h后，測(cè)定其TG和TC，取血脂高于正常對(duì)照組平均值20%的大鼠用于建立2型糖尿病模型。將合格高脂大鼠在禁食不禁水24 h后腹腔注射給藥STZ 25 mg/kg 1次，在注射后72 h測(cè)定其血糖濃度，隨機(jī)血糖大于11 mmol/L的大鼠即為建模成功。

2.1.2 分組與給藥。將建模成功的2型糖尿病模型大鼠隨機(jī)分為5組，即模型組、TAPA-1組（1 mg/kg）、TAPA-5組（5 mg/kg）、TAPA-25組（25 mg/kg）以及羅格列酮組（2 mg/kg），每組10只，后4組即為給藥組。給藥組每日灌胃相應(yīng)藥物1次，連續(xù)4周。正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積的蒸餾水。

2.1.3 檢測(cè)指標(biāo)。給藥期間每周測(cè)定各組大鼠攝食量、體質(zhì)量、飲水量以及隨機(jī)血糖水平各1次。末次給藥后1 h測(cè)定各組大鼠口服糖耐量，即禁食不禁水4 h后，灌胃葡萄糖2 g/kg，并分別于灌胃葡萄糖后0、0.5、1、2 h（前期研究表明2 h內(nèi)血糖濃度已達(dá)峰值）剪尾采血，測(cè)定血糖濃度，計(jì)算其血糖-時(shí)間曲線下面積（AUC）。

2.2 TAPA對(duì)胰島素敏感性的影響

2.2.1 HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立。采用高濃度胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)法復(fù)制HepG2細(xì)胞的胰島素抵抗模型[7]。將HepG2細(xì)胞懸液用含體積分?jǐn)?shù)為2%小牛血清DMEM洗滌1次，然后按1×106個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞貼壁后用不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液洗滌2次，加入1 ml新配制的含有或不含有5×10－7mol/L人胰島素的培養(yǎng)液（不加胰島素者為對(duì)照）于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育16 h，用不含胰島素的培養(yǎng)液洗滌1次，共20 min。在含5×10－7mol/L胰島素培養(yǎng)液中孵育的HepG2細(xì)胞稱為模型細(xì)胞，不含胰島素培養(yǎng)液中孵育的稱為對(duì)照細(xì)胞，測(cè)定兩種細(xì)胞的胰島素敏感性。

2.2.2 分組與給藥。試驗(yàn)分為6組，即空白模型組、空白對(duì)照組、TAPA-M組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L TAPA的模型細(xì)胞組）、TAPA-C組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L TAPA的對(duì)照細(xì)胞組）和羅格列酮-M組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L羅格列酮的模型細(xì)胞組）、羅格列酮-C組（培養(yǎng)液含1×10－5mol/L羅格列酮的對(duì)照細(xì)胞組）。

2.2.3 檢測(cè)指標(biāo)。采用3H-d-葡萄糖摻入實(shí)驗(yàn)（檢測(cè)細(xì)胞的葡萄糖摻入率）評(píng)價(jià)細(xì)胞的胰島素敏感性[3]。在兩種胰島素濃度（分別為1×10－9mol/L和1×10－7mol/L）下，測(cè)定“2.2.2”項(xiàng)下各組細(xì)胞的葡萄糖摻入率。

具體操作步驟：取分別按“2.2.2”項(xiàng)下分組加入不含小牛血清的DMEM培養(yǎng)液（1 ml/孔），于37 ℃、5%CO2條件下預(yù)孵育0.5 h，加入3H-d-葡萄糖（1.3 μCi/ml）孵育2 h，加入冰冷的磷酸鹽緩沖液快速洗滌細(xì)胞以終止反應(yīng)。細(xì)胞用20%KOH 0.5 ml溶解后，轉(zhuǎn)移至玻璃試管中，取出100 μl細(xì)胞溶解液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，冷乙醇溶液洗滌2次，室溫下3 000 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min后棄去上清液，將沉淀物（糖原）倒置沉積在直徑為2 cm的濾紙片上（反復(fù)沖洗），濾紙片用冷藏于4 ℃的冷乙醇攪拌洗滌4次，共3 h。將濾紙片烘干后置于10 ml閃爍液中測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。根據(jù)3H-d-葡萄糖的比放射性、細(xì)胞融解液的蛋白質(zhì)濃度及糖原的放射性，可計(jì)算出3H-d-葡萄糖的摻入率，單位為mmol·g（Pro）/h。公式為：葡萄糖的摻入率＝糖原的放射性計(jì)數(shù)（cpm）/[3H-d-葡萄糖的比放射性（Bq/mmol）×細(xì)胞融解液的蛋白質(zhì)濃度（g/L）×細(xì)胞融解液體積（ml）×溫育時(shí)間（h）]。

2.3 胰島素釋放試驗(yàn)

2.3.1 分組與給藥。試驗(yàn)分為給藥組和空白對(duì)照組，給藥組包括3個(gè)TAPA組與格列齊特組，即TAPA-Ⅰ組（1×10－10mol/L）、TAPA-Ⅱ組（1×10－8mol/L）、TAPA-Ⅲ組（1×10－6mol/L）、格列齊特組（1×10－5mol/L）。

2.3.2 檢測(cè)指標(biāo)。將βTC3細(xì)胞接種于24孔板，生長(zhǎng)3 d待細(xì)胞50%融合后，按“2.3.1”項(xiàng)下分組換上相應(yīng)的培養(yǎng)液，再孵育24 h，每孔取100 μl培液檢測(cè)胰島素含量。

2.4 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 降糖作用

3.1.1 建模結(jié)果。大鼠經(jīng)高脂喂食及STZ處理后，部分動(dòng)物死亡，少數(shù)在處理結(jié)束后隨機(jī)血糖低于11 mmol/L，剩余53只大鼠隨機(jī)血糖高于11 mmol/L，為2型糖尿病大鼠造模成功，供試驗(yàn)用。

3.1.2 各組大鼠攝食量、體質(zhì)量和飲水量的變化。高脂喂養(yǎng)大鼠在STZ誘導(dǎo)后，其攝食量、體質(zhì)量和飲水量與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥組大鼠在給藥4周后，體質(zhì)量有所增加[給藥前（263.1±17.7）g，給藥28 d后（289.1±20.0）g]，但給藥組大鼠的攝食量、體質(zhì)量和飲水量與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.1.3 各組大鼠血糖水平的變化。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的血糖濃度明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，給藥組大鼠給藥4周后其血糖濃度均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TAPA-25組大鼠在給藥后，血糖濃度與羅格列酮組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；且都在給藥1周后，血糖濃度就明顯下降，說明TAPA-25組降糖效果與羅格列酮組相當(dāng)。TAPA-1組在給藥4周后血糖濃度明顯降低；TAPA-5組在給藥3周后血糖濃度明顯降低，并維持到給藥4周后；而TAPA-25組在給藥1周后血糖濃度就明顯降低，并維持到給藥4周后。4周后，TAPA各劑量組大鼠的血糖濃度間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見，TAPA的降糖效果與給藥劑量和時(shí)間呈正相關(guān)，劑量越高，其降糖作用越快速。各組大鼠的血糖濃度比較見表1。

表1 各組大鼠的血糖濃度比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of blood glucose concentration of rats in each group（，n＝10）

表1 各組大鼠的血糖濃度比較（，n＝10）Tab 1 Comparison of blood glucose concentration of rats in each group（，n＝10）

與正常對(duì)照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05

3.1.4 各組大鼠糖耐量的變化。高脂大鼠在STZ誘導(dǎo)4周后，其糖耐量明顯降低，模型組與正常對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；給藥組大鼠的糖耐量均顯著改善（P＜0.05），給藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0.05）。各組大鼠的糖耐量比較見表2。

表2 各組大鼠的糖耐量比較（，n＝10）Tab 2 Comparison of glucose tolerance of rats in each group（，n＝10）

表2 各組大鼠的糖耐量比較（，n＝10）Tab 2 Comparison of glucose tolerance of rats in each group（，n＝10）

與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

3.2 TAPA對(duì)胰島素敏感性的影響

胰島素抵抗HepG2空白模型細(xì)胞組的葡萄糖摻入率在不同濃度胰島素刺激下均低于空白對(duì)照細(xì)胞組（P＜0.01），說明模型細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗，建模成功；加入TAPA或羅格列酮的對(duì)照細(xì)胞組與未加入藥物的對(duì)照細(xì)胞組葡萄糖摻入率無顯著差異（P＞0.05），說明TAPA與羅格列酮均無刺激胰島素分泌作用，對(duì)正常對(duì)照細(xì)胞的葡萄糖摻入率無影響；而加入TAPA或羅格列酮的模型細(xì)胞組的葡萄糖摻入率較未加入藥物的模型細(xì)胞組顯著提高（P＜0.01），加入TAPA與加入羅格列酮的模型細(xì)胞組的葡萄糖摻入率無顯著差異（P＞0.05），說明TAPA與羅格列酮均有胰島素增敏作用，且二者作用強(qiáng)度相當(dāng)。各組細(xì)胞的葡萄糖摻入率比較見表3。

3.3 TAPA對(duì)βTC3細(xì)胞胰島素釋放的影響

格列齊特為第二代磺脲類口服降糖藥，主要通過刺激胰島素分泌而發(fā)揮降糖作用。在葡萄糖濃度為11.1 mmol/L的條件下，與空白對(duì)照組比較，格列齊特有明顯的刺激βTC3細(xì)胞分泌胰島素的作用；1×10－10～1×10－6mol/L濃度范圍內(nèi)的TAPA對(duì)βTC3細(xì)胞的胰島素釋放無明顯影響，與空白對(duì)照組無明顯差異，說明TAPA無刺激胰島素分泌作用。各組細(xì)胞的胰島素釋放量比較見表4。

表3 各組細(xì)胞的葡萄糖摻入率比較（，mmol·（gPro）/h，n＝10）Tab 3 Comparison of incorporation amount of glucose in each group cell（，mmol·（gPro）/h，n＝10）

表3 各組細(xì)胞的葡萄糖摻入率比較（，mmol·（gPro）/h，n＝10）Tab 3 Comparison of incorporation amount of glucose in each group cell（，mmol·（gPro）/h，n＝10）

與對(duì)照細(xì)胞比較：＊P＜0.01；與模型細(xì)胞比較：#P＜0.01vs.control cell：＊P＜0.01；vs.model cell：#P＜0.01

表4 各組細(xì)胞的胰島素釋放量比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of insulin secretion in each group cell（，n＝10）

表4 各組細(xì)胞的胰島素釋放量比較（，n＝10）Tab 4 Comparison of insulin secretion in each group cell（，n＝10）

與空白對(duì)照組比較：＊P＜0.01vs.blank control group：＊P＜0.01

4 討論

胰島素抵抗是2型糖尿病的重要病因和顯著特征，因此也是近年來國(guó)際上針對(duì)代謝相關(guān)疾病的研究熱點(diǎn)。胰島素抵抗不但是2型糖尿病的重要病理基礎(chǔ)，同時(shí)還與相關(guān)的并發(fā)癥有密切關(guān)系，所以針對(duì)胰島素抵抗的治療成為治療糖尿病的關(guān)鍵，并可起到“一石多鳥”之效：既可降低糖尿病患者的高血糖、保護(hù)胰島β細(xì)胞免受損害、延緩2型糖尿病的進(jìn)展，又可在改善大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展、降低其病死率方面起到積極作用[8]。針對(duì)胰島素抵抗的治療藥物主要為胰島素增敏劑，噻唑烷二酮類藥是一類新型的并較為公認(rèn)的胰島素增敏劑，但該類藥因安全性問題已大部分退市，目前臨床上亟需開發(fā)更加安全、有效的胰島素增敏劑。

筆者前期研究表明，蛻皮甾酮具有胰島素增敏作用，且與噻唑烷二酮類藥具有不同的作用機(jī)制。TAPA是在蛻皮甾酮的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾所得，因此首先考慮TAPA可能具有與蛻皮甾酮相同的作用效果與機(jī)制。為此，前期采用HepG2細(xì)胞檢測(cè)了TAPA對(duì)葡萄糖消耗量的影響。本研究進(jìn)一步從體內(nèi)研究TAPA對(duì)2型糖尿病大鼠的血糖水平、糖耐量的影響，同時(shí)對(duì)TAPA的作用機(jī)制在細(xì)胞水平作了初步探討。以上實(shí)驗(yàn)均以研究組前期對(duì)蛻皮甾酮的系列研究作為基礎(chǔ)，且《化合物經(jīng)口急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)》顯示TAPA屬于1～2級(jí)（無毒～實(shí)際無毒），以此確定的實(shí)驗(yàn)方案、檢測(cè)指標(biāo)以及給藥劑量[9-10]。

本研究結(jié)果表明，給藥4周，TAPA可降低2型糖尿病大鼠的血糖水平，其中TAPA-25組的降糖效果與2 mg/kg胰島素增敏劑羅格列酮組相當(dāng)，同時(shí)TAPA各劑量組以及羅格列酮組均能改善2型糖尿病模型大鼠的糖耐量，各給藥組間結(jié)果相當(dāng)。因此，初步體內(nèi)試驗(yàn)證明，在蛻皮甾酮結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的TAPA能降低糖尿病關(guān)鍵指標(biāo)——血糖濃度和升高糖耐量。其次，通過細(xì)胞水平的機(jī)制研究表明，TAPA可增加胰島素抵抗模型HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量[6]以及提高HepG2細(xì)胞的葡萄糖摻入率，并且在相同的藥物濃度1×10－5mol/L條件下，效果與胰島素增敏劑羅格列酮相當(dāng)。同時(shí)，通過對(duì)βTC3細(xì)胞的胰島素釋放試驗(yàn)證明，在葡萄糖濃度為11.1 mmol/L的條件下，1×10－10～1×10－6mol/L濃度范圍內(nèi)的TAPA對(duì)βTC3細(xì)胞的胰島素釋放沒有明顯的影響，說明TAPA不具有刺激胰島素分泌的作用。

綜上，在蛻皮甾酮結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上修飾得到的TAPA可顯著降低2型糖尿病模型大鼠的血糖濃度，升高糖耐量；經(jīng)細(xì)胞水平研究證實(shí)，TAPA可提高胰島素抵抗細(xì)胞模型HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量及摻入率，但無促進(jìn)胰島素分泌作用。提示TAPA的降糖作用可能與原型蛻皮甾酮一致，與羅格列酮同屬胰島素增敏劑，通過改善胰島素的敏感性達(dá)到體內(nèi)降糖作用。后期亟需開展多模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證其體內(nèi)的藥效和安全性，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以期將TAPA開發(fā)成具有全新作用機(jī)制、更加安全有效的胰島素增敏劑。

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