鄭新添，黃其春，黃翠琴，湯小真，楊小燕

(龍巖學院 生命科學學院/福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術研究中心，福建 龍巖 364012)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由PED 病毒(PEDV)引起的以豬水樣腹瀉、嘔吐和脫水為特征的高度接觸性腸道傳染病。PED 可危害各種年齡豬群，其中以哺乳仔豬尤為嚴重[1]。PED已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的重要腹瀉病之一[2]。

快速診斷是控制PED 的前提條件之一，目前PED 的診斷技術包括流行病學診斷、臨床病理診斷、病毒分離與鑒定、免疫熒光法、免疫電鏡法、ELISA 法、普通RT-PCR 技術、實時熒光定量PCR技術等[3-4]，上述診斷方法在臨床應用，特別是獸醫(yī)基層應用方面均存在一些不足：病原分離與鑒定，過程繁瑣，耗時長；免疫血清學技術敏感性不夠高；普通RT-PCR 或熒光定量PCR 診斷技術需要昂貴的儀器設備。因此均難以滿足臨床，特別是基層獸醫(yī)臨床診斷需求。

環(huán)介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新的DNA 擴增方法。該技術依賴于自動循環(huán)的鏈置換反應，在等溫條件下，1 h 內即能擴增1×109拷貝的靶序列[5]，其操作方便，所需設備簡單，反應結果可通過肉眼觀察直接判斷[6]。LAMP 技術具有特異性強、靈敏度高、快速和操作簡單等優(yōu)點，在核酸研究、病原學檢測等方面得到了廣泛的應用[7]。本研究建立了PEDV的LAMP 檢測方法，為豬腹瀉的臨床病原學快速診斷提供了新的方法。

1 材料和方法

1.1 病毒株及臨床樣品 PEDV(CV777 株)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)華毒株及輪狀病毒(RV)NX株由山東畜牧獸醫(yī)研究所惠贈；豬瘟病毒(CSFV)來自豬瘟活疫苗(細胞源，中牧實業(yè)有限公司)；埃希氏大腸桿菌(ATCC25922)由本研究中心保存；85 份豬糞便樣品采自龍巖地區(qū)養(yǎng)豬場PED 疑似病例。

1.2 主要試劑 Bst DNA 聚合酶、MgSO4購自New England Biolabs 公司；SYBR Green I 染料、甜菜堿(Betaine)購自Sigma 公司；DNA Marker DL2000和pMD18-T 載體等購自寶生物工程(大連)有限公司；M-MuLV Reverse Transcriptase 和TRIzol RNA 提取試劑等購自生工生物工程(上海)有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司。

1.3 引物設計與合成 根據(jù)GenBank 登錄的PEDV(KC189944)NP 基因核酸序列，設計擴增PEDV 的LAMP 引物(表1)，RT-PCR 引物序列為：PEDV-f：5'-TTGGCATTTCTACTACCTCGGA-3' 和PEDV-r：5'-AGATGAAAAAGGTACTGCGTTCC-3'，擴增片段540 bp，引物由上海生工生物技術服務有限公司合成。

1.4 核酸模板的制備 PEDV、TGEV、RV、CSFV及腹瀉糞便樣品RNA 的提取采用TRIzol 提取法，并反轉錄制備其cDNA。大腸桿菌DNA 提取采用細菌基因組DNA 提取試劑盒，具體操作步驟參照說明書。

表1 PEDV LAMP 引物Table 1 LAMP primers of PEDV

1.5 LAMP外引物的驗證及重組質粒的構建 對外引物(F3/B3)進行普通PCR 擴增驗證。25 μL 反應體系：2×PCR Master Mix 12.5 μL、外引物(F3/B3)各0.5 μL(20 μmol/L)、PEDV cDNA 1 μL、ddH2O 10.5 μL。反應條件：94 ℃5 min；94 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃30 s，共30 個循環(huán)；72 ℃5 min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，純化后克隆至pMD18-T 載體，構建重組質粒pMD-NP，并對其測序驗證。

1.6 LAMP反應體系的建立及優(yōu)化 建立25 μL LAMP 反應體系，并對引物、dNTPs、Betaine、MgSO4等成份的濃度及擴增溫度進行優(yōu)化。在反應結束后在反應管中加入1 μL SYBR Green I 染料，肉眼觀察顏色變化。同時取2 μL 產物經瓊脂糖電泳凝膠檢測。

1.7 LAMP特異性試驗 采用建立的LAMP 方法對PEDV、TGEV、RV、CSFV、大腸桿菌的核酸進行LAMP 檢測，分別觀察SYBR Green I 染色及LAMP產物瓊脂糖凝膠電泳結果。

1.8 LAMP敏感性試驗 利用紫外分光光度計測定重組質粒濃度，并計算拷貝數(shù)。將其10 倍梯度稀釋作為模板，采用LAMP 方法進行敏感性檢測。同時進行普通RT-PCR 檢測，比較兩者敏感性。

1.9 LAMP的臨床樣品檢測 提取85 份豬糞便樣品總RNA，分別利用RT-PCR 技術[8]和已建立的LAMP 技術檢測PEDV，比較兩者的檢出率。

2 結果

2.1 外引物的驗證及重組質粒的構建 以PEDV 的cDNA 為模板，結果表明，采用LAMP 外引物F3/B3，經PCR 擴增出目的片段約200 bp，與預期大小相符(圖1)，將其克隆至pMD18-T 中構建重組質粒pMD-NP，測序結果與預期(217 bp)一致。將其作為LAMP 陽性標準品。

圖1 外引物PCR 擴增驗證Fig.1 Verification of outer primers by PCR

2.2 LAMP體系的優(yōu)化 通過對LAMP 反應條件的優(yōu)化，確定最佳反應體系為25 μL：10×Bst Thermo pol Buffer 2.5μL、F3(10 μmol/L)0.5 μL、B3(10 μmol/L)0.5 μL、FIP(10 μmol/L)4 μL、BIP(10 μmol/L)4 μL、dNTPs(1.6 mmol/L)2 μL、Betaine(5 mol/L)5 μL、MgSO4(100 mmol/L)0.9 μL，Bst DNA 聚合酶(8 U/μL)1 μL、cDNA 1 μL，ddH2O 補充至25 μL。結果表明，擴增結束后，PEDV 為模板的反應體系管呈綠色，陰性對照呈橙色(圖2A)。將反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示PEDV 的陽性擴增物呈現(xiàn)梯狀條帶，陰性對照無擴增(圖2B)。

圖2 LAMP 擴增結果Fig.2 Amplification of LAMP

2.3 LAMP特異性試驗 特異性試驗表明，建立的LAMP 方法僅對PEDV 有擴增條帶，產物經SYBR Green I 染色后呈綠色，而CSFV 及PRV 等擴增產物呈橙色(圖3A)。PEDV 的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀條帶，而其他核酸無擴增(圖3B)，表明該LAMP 反應特異性強。

圖3 LAMP 的特異性試驗Fig.3 Specificity test of LAMP

2.4 LAMP敏感性試驗 重組質粒pMD-NP 經10倍倍比稀釋(1.6×100拷貝/μL～1.6×106拷貝/μL)作為模板，分別進行LAMP 檢測和RT-PCR 擴增，結果表明，LAMP 的檢測下限為16 拷貝/μL(圖4A)，而RT-PCR 的檢測下限為1.6×102拷貝/μL(圖4B)，因此LAMP 的敏感性高于RT-PCR。

2.5 LAMP臨床檢測 對85 份疑似PEDV 感染豬的糞便樣品分別用RT-PCR 及LAMP 檢測，結果顯示85 份樣品中，LAMP 及RT-PCR 的陽性率分別為37.6 %(32/85)及34.1 %(29/85)，LAMP 檢測的敏感性高于RT-PCR。

3 討論

本研究根據(jù)PEDV NP 基因的保守區(qū)域，設計LAMP 引物，初步建立了LAMP 檢測方法。引物設計是建立LAMP 檢測方法的關鍵步驟。LAMP 引物一般覆蓋靶基因的6 個位點，由4～6 條引物組成，與PCR 相比，LAMP 引物的多個位點增強了特異性，本研究的結果也顯示，僅對PEDV 核酸具有特異性的擴增反應，而對其他病原微生物如CSFV、PCV2 和PRV 等的核酸的擴增均為陰性，顯示了良好的特異性。另一方面，LAMP 體系多條引物共存也增加了反應體系的復雜性，因此應對其濃度，反應溫度等進行優(yōu)化。本研究結果顯示該反應引物FIP、BIP、F3 及B3 的最佳濃度分別為1.6 μM、

圖4 LAMP 敏感性試驗Fig.4 Sensitive test of LAMP

1.6 μM、0.2 μM 和0.2 μM，反應溫度(63 ℃～65 ℃)的擴增結果無明顯差異。本研究建立的LAMP 的最低檢測下限為16 拷貝/μL，該靈敏度高于RT-PCR。LAMP 反應在單一的反應溫度65 ℃完成，避免了PCR 的變性、退火等多個溫度，因此其時間更為節(jié)約，整個反應可在40 min～60 min 內完成。在檢測結果判斷方面，LAMP 結果僅需肉眼觀察產物顏色即可判斷，無需電泳，比PCR 更為快速和方便。LAMP 檢測方法的結果還可通過肉眼直接觀察其反應副產物焦磷酸鎂白色沉淀進行判斷，這樣可以避免反應后開蓋添加染料可能造成氣溶膠污染。但若目標基因較低，沉淀物太少其結果受觀察者的影響大，可能降低檢測的靈敏度[9]，因此，反應后添加染料仍然具有更易觀察的優(yōu)勢。鈣黃綠素可直接添加至反應體系中，反應結果也容易判斷，但該染料可能影響擴增，因此還需進一步研究[10]。總之，本研究建立的PEDV LAMP 檢測方法是一種快速、特異、敏感的檢測方法，在疫病的快速診斷及PEDV 病原學研究等相關領域具有重要的應用前景。

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