馮思源，馬建偉，杜慧慧，李能章，彭遠(yuǎn)義

(西南大學(xué)動物科技學(xué)院重慶市牧草與草食家畜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是一種能夠引起牛、豬、雞、兔等多種動物產(chǎn)生以出血性敗血癥或呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的重要病原菌[1]。以往在牛群中流行的主要是以引起出血性敗血癥為主的莢膜血清B 型，但近年來在牛群中發(fā)現(xiàn)的主要是以引起肺部感染為主的莢膜血清A 型[2]。目前牛呼吸系統(tǒng)疾病(BRD)已成為危害養(yǎng)牛業(yè)的主要疫病，發(fā)病率50 %～100 %，病死率10 %～50 %，Pm A型是導(dǎo)致BRD 臨床綜合癥的主要細(xì)菌性病原之一，環(huán)境應(yīng)激尤其是運(yùn)輸應(yīng)激是其主要誘因。我國自2008 年報道從發(fā)病牛群中分離鑒定到多殺性Pm A型以來[3]，因該病原引起的疾病在我國許多省市均有發(fā)生，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

由于Pm 血清型眾多，不同血清型之間交叉免疫力較低，甚至沒有，而我國目前所用疫苗主要是針對引起牛出血性敗血癥的Pm B 型傳統(tǒng)疫苗，對A 型無交叉保護(hù)作用[5]，缺乏針對牛Pm A 型的疫苗。目前尚無商品化的有效疫苗上市，需要進(jìn)一步篩選有效抗原蛋白。本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)表明Pm CQ2 株的pm0442 和pm0979 基因在接種的鼠肺臟中大量表達(dá)，推測這兩個基因在肺臟的大量表達(dá)可能對毒力起著關(guān)鍵性的作用[6]。因此，為研究Pm CQ2株pm0979 和pm0442 基因編碼的PM0979 和PM0442蛋白的免疫原性，本研究通過原核表達(dá)了這兩種蛋白，并分別免疫小鼠后以同源菌株攻毒，對其免疫效果進(jìn)行了評價，為鑒定具有免疫原性的細(xì)菌蛋白及亞單位疫苗的研制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株、血清及實(shí)驗(yàn)動物 牛源A 型Pm CQ2株、大腸桿菌感受態(tài)DH5α 和BL21、?？筆m 陽性血清均為本實(shí)驗(yàn)室保存；6 周齡昆明小鼠購自重慶中藥研究所。

1.2 主要試劑 弗氏完全佐劑、弗式不完全佐劑，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(IgG-HRP)均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；限制性內(nèi)切酶Eco R Ⅰ、Xho Ⅰ均購自TaKaRa 公司；DNA Marker、蛋白Marker 和細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Pm CQ2 株pm0979 和pm0442 基因序列(15601865 和15601865)設(shè)計(jì)兩對引物：pm0979R：5'-GAGTCA CTCGAG TTATTTTGCG TTAGTACAAT-3'(Xho Ⅰ)/pm0979F：5'-GAGTCA GAATTC ATGGTTGCTGGCGCATTAACT-3'(Eco RⅠ)；pm0442R：5'-GAGTCA CTCGAG AATCACTTCTTTTA ACTTCTTCTG-3'(XhoⅠ)/pm0442F：5'-GAGTCA GA ATTC TGTTTTGATAAAGAGAGCAAAG-3'(Eco RⅠ)。引物由上海Invitrogen 公司合成。

1.4 目的基因的PCR擴(kuò)增及原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以Pm CQ2 基因組為模板；PCR 反應(yīng)體系50 μL；反應(yīng)條件：95 ℃5 min；95 ℃1 min、57 ℃1 min(pm0442)、72 ℃1 min 30 s、95 ℃1 min、56 ℃1 min(pm0979)、72 ℃1 min 30 s，30 個循環(huán)；72 ℃10 min。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。采用Eco RⅠ和Xho Ⅰ雙酶切目的基因pm0979 和pm0442 分別克隆于pET-32a 和pET-30a 質(zhì)粒中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pm0979 和pET-pm0442，由上海Invitrogen公司測序。

1.5 重組蛋白表達(dá)的檢測及鑒定 取測序正確的pET-pm0442 和pET-pm0979 轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個菌落，37 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm值0.4～0.6，加入IPTG 至終濃度為l mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)3 h，同時設(shè)空白載體對照。12 % SDS-PAGE 電泳檢測，以5 %脫脂乳1∶16 稀釋的?？筆m 陽性血清為一抗，以1∶10 000 倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的抗牛IgG 為二抗，進(jìn)行western blot 鑒定。采用尿素法裂解菌體，使用Ni-NTA Superflow Cartridge His 親和層析柱純化蛋白。純化后用Bradford 法測定濃度。

1.6 間接ELISA試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[7]和[8]間接ELISA 試驗(yàn)的通用方法，并加以改進(jìn)。以碳酸鹽緩沖液將rPM0979、rPM0442 重組蛋白稀釋后每孔100 μL(濃度為50 μg/mL)包被酶標(biāo)板。采用2 % BSA 封閉液，4 ℃封閉過夜，每孔加入1∶200 稀釋的待檢血清100 μL，37 ℃作用1 h，以羊抗鼠IgG-HRP 為二抗，通過TMB 底物顯色，測定OD450nm值進(jìn)行被檢血清檢測。

1.7 動物攻毒試驗(yàn) 6 周齡小鼠隨機(jī)分成3 組，即rPM0442 組、rPM0979 組、PBS 對照組，每組10只。用純化后的重組蛋白加弗氏完全佐劑乳化后免疫昆明小鼠，多點(diǎn)皮下注射，每只50 μg 重組蛋白。2 周后加強(qiáng)免疫1 次，劑量同上，佐劑改為弗氏不完全佐劑。同時設(shè)生理鹽水對照組(10 只)。二免后14 d 用2 倍半數(shù)致死量(LD50)(LD50為1×107cfu)Pm CQ2 株攻毒，攻毒途徑為肌肉注射，攻毒后觀察小鼠精神狀態(tài)，死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增與克隆 以Pm 基因組DNA為模板，利用特異性引物擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增結(jié)果顯示，PCR 產(chǎn)物分別約為400 bp(pm0979)和700 bp(pm0442)，與預(yù)期相符(圖1)，并構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-pm0442 和pET-pm0979，測序結(jié)果表明，pm0442和pm0979 基因與原序列的大小完全一致，分別為691 bp 和391 bp，各編碼229 和136 個氨基酸。

圖1 目的基因的PCR 擴(kuò)增Fig.1 Amplification of the target genes by PCR

2.2 重組蛋白的原核表達(dá)及鑒定 pET-pm0442 和pET-pm0979 經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE 結(jié)果顯示，重組蛋白rPM0979 和rPM0442 獲得表達(dá)，其分子量約為41.8 ku 和21.6 ku(圖2A)，北且western blot 結(jié)果表明，兩種重組蛋白具有免疫學(xué)活性(圖2B)。

圖2 pm0442、pm0979 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(A)和western blot(B)鑒定結(jié)果Fig.2 SDS-PAGE(A)and western blot(B)analysis of the recombinant protein PM0442,PM0979

2.3 ELISA抗體檢測結(jié)果 分別以rPM0442 和rPM0979 作為包被抗原進(jìn)行間接ELISA 試驗(yàn)，檢測二免10 d 后小鼠血清特異性抗體水平。

結(jié)果顯示，rPM0442 組和rPM0979 組的小鼠抗體水平基本相同，而對照組的抗體則始終處于較低的水平。rPM0979 組的血清抗體水平顯著高于對照組,差異極顯著(p<0.01)；rPM0442 組的血清抗體水平顯著高于對照組，差異極顯著(p<0.01)。rPM0979組的血清抗體水平雖略高于rPM0442 組，但兩者之間差異并不顯著(p>0.05)(圖3)。

圖3 免疫小鼠血清抗體水平Fig.3 The assay of serum antibody in mice

2.4 免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果 各組實(shí)驗(yàn)小鼠于二免后14 d 以Pm CQ2 進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明，經(jīng)rPM0979、rPM0442 免疫后的小鼠均可以在一定程度上抵抗強(qiáng)毒株的攻擊，其中以PM0979 重組蛋白的保護(hù)效果較好，保護(hù)率為60 %，而PM0442 重組蛋白也可以為免疫小鼠提供一定的保護(hù)(表1)。

表1 重組蛋白免疫攻毒結(jié)果Table 1 Protection of immunized mice against lethal challenge with bovine Pm

3 討論

近年來，Pm 疫苗的研制重點(diǎn)主要集中于巴氏桿菌的毒力因子。其中，Pm OMPs 中多種成分均具有較好的免疫原性，是研究的熱點(diǎn)。有研究表明，Pm 基因pm0979、pm0442 編碼的蛋白PM0979 和PM0442 是兩個新發(fā)現(xiàn)的蛋白[9-10]，但它們的具體功能還未研究清楚。Ren 等研究表明，PM0979、PM0442 可能參與氨基酸的代謝調(diào)控，并與營養(yǎng)免疫存在密切關(guān)系[11]。Hatfaludi 等研究顯示rPM0442為可溶蛋白，具有免疫原性；rPM0979 為不可溶蛋白，具有免疫原性，攻毒試驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種蛋白對禽均無保護(hù)性[12]。

本研究實(shí)現(xiàn)了牛源Pm CQ2 菌株pm0442、pm0979 基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)，SDS-PAGE 及ELISA 結(jié)果顯示：重組蛋白PM0442、PM0979 大小與預(yù)期相符，并具有免疫學(xué)活性，但動物實(shí)驗(yàn)和ELISA 檢測表明，rPM0979 與rPM0442 均能夠誘導(dǎo)較高的抗體水平，并且抗體水平相當(dāng)，但rPM0979保護(hù)率明顯高于rPM0442，可達(dá)60%，推測PM0979可能是一種保護(hù)性抗原，可作為一種疫苗的候選，但其功能需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

PM0442、PM0979 在Pm 的致病力方面有著重要作用，但關(guān)于這方面的研究較少。因此，對于pm0979、pm0442 基因值得進(jìn)一步研究。

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