鄭惠文，李志杰，張艷萍，包珂巖，鄭永勝，劉長軍，王笑梅

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽免疫抑制病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001)

雞馬立克氏病病毒(Marek's disease viruses，MDV)能夠引起雞的淋巴細(xì)胞增生性疾病[1]，是致瘤性最強(qiáng)的皰疹病毒之一。在MDV 編碼的基因中，pp38、vIL-8、ICP4、R-LORF4 與MDV 致瘤性相關(guān)，其中Meq 基因是主要的致瘤基因[2-3]。最近發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)I 型MDV(MDV-1)編碼的miRNAs 與病毒致瘤性具有重要關(guān)系。miRNAs 是一類具有19 nt～25 nt內(nèi)源性不編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA，通過與靶mRNA 3'UTR 完全或不完全的互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA 降解或翻譯抑制[4]。MDV-I 共編碼14 種miRNAs，由于它們在MDV 轉(zhuǎn)化的腫瘤和T 淋巴細(xì)胞系中有較高的表達(dá)量[5]，被認(rèn)為在致瘤性方面具有重要作用。我們前期基因芯片檢測結(jié)果表明M4-5P、M8-3P 和M12-3P 在腫瘤組織中具有較高的表達(dá)量。本研究通過檢測強(qiáng)毒株GA 株和疫苗株CVI988 株編碼的miRNAs M4-5P、M8-3P 和M12-3P 體內(nèi)差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNAs 表達(dá)量與病毒載量有關(guān)，為進(jìn)一步研究miRNAs 功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株及實(shí)驗(yàn)動物 MDV 強(qiáng)毒GA 株購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所(ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室繼代培養(yǎng)至第5 代，并在雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中增殖一代用于雛雞接種；MDV 活疫苗毒株(CVI988 株)購自梅里亞公司，在CEF 中增殖一代后用于雛雞接種。1 日齡SPF 白來航雞由本研究所SPF 實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 主要試劑 miRNA 提取試劑盒購自QIAGEN公司；miRNA 檢測試劑盒購自復(fù)能基因公司；組織基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA 膠回收試劑盒、小型質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；pMD18-T 載體、r Taq DNA 聚合酶、PCR 試劑及SYBR 熒光定量PCR(qPCR)試劑盒均購自TaKaRa 公司。

1.3 引物設(shè)計 參考GenBank 中MDV 超強(qiáng)毒Md5株相關(guān)基因序列，應(yīng)用Primer Premier5 軟件設(shè)計M4-5P、M8-3P 和M12-3P 引物(表1)，由哈爾濱博仕生物公司合成；上、下游為通用引物購自廣州復(fù)能基因有限公司。

表1 qPCR 的引物Table 1 Primer used in the qPCR

1.4 動物實(shí)驗(yàn) 將90 只1 日齡SPF 雞隨機(jī)分成A、B、C 3 組，每組30 只。A 組以0.2 mL/只(2 000 pfu)的劑量，腹腔注射MDV GA 株，B 組以相同的劑量腹腔接種MDV CVI988 株，C 組作為空白對照，負(fù)壓隔離器內(nèi)飼養(yǎng)。每組分別在接種后7 d、14 d、21 d、28 d 和35 d 時隨機(jī)選擇3 只迫殺，采集肝臟及脾臟。保存于RNAlater 中。

1.5 miRNA的提取 分別取各組20 mg 采集的組織，提取miRNA 后取100 ng 反轉(zhuǎn)錄后作為待檢樣品保存于-70 ℃，具體操作步驟按miRNA 提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 陽性標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒的制備 以提取感染Md5株病毒的CEF 總DNA 為模板，利用各miRNA 的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增特異片段，將擴(kuò)增的目的片段分別克隆到pMD18-T 載體中構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒pMD-M4-5P、pMD-M8-3P 和pMD-M12-3P。利用分光光度計測定重組質(zhì)粒濃度，稀釋至1.0×1010拷貝/μL，于-70 ℃冰箱保存。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及miRNA表達(dá)量的測定

1.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別將pMD-M4-5P、pMD-M8-3P 和pMD-M12-3P 以10 倍倍比稀釋至10拷貝/μL，作為qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)模板，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線時依次加入(1.0×101拷貝/μL～1.0×108拷貝/μL 共8個稀釋度)。反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95 ℃10 s、58 ℃20 s、72 ℃15 s；在40個循環(huán)內(nèi)動態(tài)檢測SYBR 熒光。采用IQ5 軟件進(jìn)行分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 miRNA 表達(dá)量的測定 按照SYBR qPCR 的方法測定要求提取的樣品RNA，每個反應(yīng)孔分別加入2 μL。在同一次反應(yīng)中分別測定加有相同樣品的3 個反應(yīng)管中的SYBR 熒光強(qiáng)度，推導(dǎo)出樣品中每miRNA 拷貝數(shù)并取對數(shù)值，所得數(shù)據(jù)用于結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以提取感染Md5 株病毒的CEF 總DNA 為模板，利用各miRNA 的引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增特異片段，將擴(kuò)增的目的片段分別克隆到pMD18-T 載體中構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)重組質(zhì)粒pMD-M4-5P、pMD-M8-3P 和pMD-M12-3P，10 倍倍比稀釋至10拷貝/μL，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，擴(kuò)增效率分別為0.994，0.999，0.997，0.989，0.997，在1.0×101拷貝/μL～1.0×108拷貝/μL 范圍內(nèi)具有良好的檢測效果(圖1，表2)。

2.2 GA株和CVI988株編碼的miRNA在肝臟中的表達(dá)分析 在肝臟中，同一感染時期強(qiáng)毒株編碼的miRNAs 表達(dá)量高于疫苗株。其中GA 株編碼的3種miRNAs(M4-5P，M8-3P，M12-3P)在早期感染時(7 d)表達(dá)量基本相同，第二次溶細(xì)胞感染時(21 d)表達(dá)量下降，隨后持續(xù)升高，轉(zhuǎn)化期后期(35 d)達(dá)到峰值(圖2A)。CVI988 株編碼的3 種miRNAs 在轉(zhuǎn)化期達(dá)到峰值，其中M4-5P 與M12-3P 表達(dá)量基本一致，M8-3P 的表達(dá)量最低(圖2B)。強(qiáng)弱毒株編碼的miRNAs 表達(dá)量均隨病毒載量變化而波動，表明強(qiáng)弱毒株編碼的miRNAs 的差異表達(dá)是由病毒滴度不同導(dǎo)致的。

圖1 qPCR 的標(biāo)準(zhǔn)曲線.Fig.1 The standard curves of the qPCR

2.3 GA株和CVI988株編碼的miRNA在胸腺中的表達(dá)分析 在胸腺中，同一感染時期強(qiáng)毒株編碼的miRNAs 表達(dá)量也高于疫苗株。其中GA 株編碼的3種miRNAs 也是在轉(zhuǎn)化期時(28 d)達(dá)到峰值，35 d 時由于胸腺的萎縮病毒載量和miRNAs 表達(dá)量均降低。其中M4-5P 的表達(dá)量最高，M12-3P 的表達(dá)量最低(圖3A)。CVI988 株編碼的3 種miRNAs 在21 d 達(dá)到峰值后表達(dá)量開始下降。其中M4-5P 的表達(dá)量最高，M8-3P 的表達(dá)量最低(圖3B)。在胸腺中，miRNAs 表達(dá)峰值也出現(xiàn)在轉(zhuǎn)化期，表明miRNAs 表達(dá)水平與致瘤性相關(guān)，強(qiáng)弱毒株編碼的miRNAs 與病毒載量趨勢的一致性表明這種差異也是由病毒滴度不同導(dǎo)致的。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)參數(shù)Table 2 Relative parameters of standard curve

圖2 GA 強(qiáng)毒株(A)和CVI988 疫苗株(B)編碼的miRNA 在肝臟中的表達(dá)Fig.2 Expression of virulent strain GA(A)and vaccine strain CVI988(B)encoded miRNAs in liver

圖3 GA 強(qiáng)毒株(A)和CVI988 疫苗株(B)編碼的miRNA 在胸腺中的表達(dá)Fig.3 Expression of virulent strain GA(A)and vaccine strain CVI988(B)encoded miRNAs in thymus

3 討論

盡管已發(fā)現(xiàn)MDV 編碼的14 種miRNAs，但它們的功能尚未完全確定，推測miRNAs 表達(dá)與MDV致瘤性相關(guān)[6]。Luo 證實(shí)M3-5P，M4-5P，M12-3P 在MDV 強(qiáng)毒株感染的宿主中表達(dá)量最高[7]，而本實(shí)驗(yàn)室前期基因芯片檢測結(jié)果表明這3 種miRNA 在腫瘤中有較高的表達(dá)量，因此本實(shí)驗(yàn)采用qPCR 的方法檢測了強(qiáng)毒株GA 株和疫苗株CVI988 株編碼的這3 種miRNAs 感染宿主后在不同時間的動態(tài)表達(dá)特征。Xu 等推測CVI988 株編碼的miRNAs 在CEF 中的高表達(dá)可能與病毒基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)在病毒復(fù)制水平方面進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明GA 株的病毒載量高于CVI988 株，其miRNAs 表達(dá)量也高于CVI988 株。在MDV 感染前期(35 d)，MDV 強(qiáng)、弱株編碼的3 種miRNAs 的表達(dá)豐度差異主要是由病毒在體內(nèi)的復(fù)制滴度差異造成的，而不是強(qiáng)弱毒株轉(zhuǎn)錄調(diào)控差異的結(jié)果。MDV 強(qiáng)毒株在體內(nèi)具有較高的復(fù)制能力，弱毒株復(fù)制能力較低；在體外，情況正好相反。Xu 等的研究表明MDV 的復(fù)制水平與miRNAs 表達(dá)的相應(yīng)規(guī)律。MDV 強(qiáng)毒株在體內(nèi)復(fù)制滴度遠(yuǎn)高于弱毒株，但在感染前期，這3 種miRNAs 在體內(nèi)的表達(dá)水平隨著病毒載量的變化而波動。我們前期研究結(jié)果顯示它們在腫瘤組織中高水平表達(dá)，綜合當(dāng)前的檢測結(jié)果，表明它們的高水平表達(dá)是發(fā)生在腫瘤形成階段。

MDV 感染對于研究miRNAs 調(diào)控腫瘤發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)、遺傳學(xué)等提供了良好的動物模型[9]。雖然兩種病毒株編碼的miRNA 差異表達(dá)的意義尚不清楚，但可以采用qPCR 方法檢測miRNA 體內(nèi)外的動態(tài)表達(dá)水平，這將有助于了解它們的相關(guān)生物學(xué)功能及其在體內(nèi)對病毒復(fù)制過程中的調(diào)控作用。

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