鐘睿博 劉雨雙 張 萍 劉竟然 趙國芬 張 峰

一種預(yù)染色凝膠電泳法的研究

鐘睿博 劉雨雙 張 萍 劉竟然 趙國芬 張 峰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 呼和浩特 010018）

凝膠電泳是常用的生化分離鑒定技術(shù)。生物分子大多在可見光區(qū)完全透明，因此在凝膠電泳之后，需要對凝膠進行染色處理才能觀察到結(jié)果，而且常規(guī)的染色方法一般步驟比較繁瑣耗時。本文開發(fā)了一種新型的預(yù)染色凝膠電泳方法(Pre-Staining Gel Electrophoresis, PSGE)，可以直觀地顯示電泳結(jié)果，并簡化凝膠電泳操作。利用PSGE成功分析了蛋白質(zhì)與兩性高分子聚合物的共價偶聯(lián)和物理吸附的效率，展示了PSGE的巨大應(yīng)用開發(fā)潛力。

瓊脂糖凝膠電泳，預(yù)染色，共價偶聯(lián)，物理吸附，蛋白質(zhì)，兩性高分子聚合物

凝膠電泳(Gel Electrophoresis)是一類生化實驗室通用的分離分析技術(shù)。按照電泳所用的介質(zhì)，有瓊脂糖凝膠電泳(Agarose Gel Electrophoresis, AGE)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PAGE)。在實驗中，除了要求被分離的物質(zhì)帶電之外，選擇這兩種電泳的一般原則是根據(jù)被分離物質(zhì)的分子量或者粒徑大小而決定的。一般瓊脂糖形成的凝膠膠孔（依賴于凝膠濃度50-200 nm）[1-2]要大于聚丙烯酰胺形成的凝膠的孔徑范圍[3-4]。像量尺的最小刻度必須小于被測量的物體才能進行測量的道理一樣，當(dāng)被分離/分析分子的粒徑與凝膠的孔徑大小基本在同一尺度范圍時，才能獲得最佳的分辨率。所以，通常分子量較大的核酸樣品選用瓊脂糖凝膠，而分子量較小的蛋白質(zhì)樣品則選用聚丙烯酰胺凝膠。在制備這兩種凝膠的過程中，瓊脂糖凝膠相對簡單，只需要加熱后冷卻即可，不像聚丙烯酰胺凝膠需要復(fù)雜的聚合單體與聚合引發(fā)劑等的準(zhǔn)確配比，以及由于膠體太軟需要另外一種濃縮膠制作加樣孔等的復(fù)雜制備程序。所以如果能利用瓊脂糖替代聚丙烯酰胺的話，可以大大簡化實驗操作過程。

由于大多數(shù)生物分子只在紫外光區(qū)域有吸收，而在可見光區(qū)域則完全透明，所以用這兩種凝膠分離/分析的結(jié)果都需要通過選擇合適的染料分子（與被分析的分子結(jié)合力強過與凝膠本身的結(jié)合力）進行染色-脫色的程序[5]。這進一步繁瑣了凝膠電泳的操作過程。如果在進行電泳之前將染料分子牢固地結(jié)合到被分析的分子上，就可以將此步驟簡化，從而提高電泳的效率。本文針對這個問題提出了一個創(chuàng)新的技術(shù)——預(yù)染色凝膠電泳(Pre-Staining Gel Electrophoresis, PSGE)：以考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue, CBB)預(yù)染牛血清蛋白(Bovine Serum Albumin, BSA)和以膠體金納米顆粒(Gold Nanoparticles, AuNPs)預(yù)染/標(biāo)記兩性高分子聚合物(Amphiphilic Polymer, AP)為例，證實了PSGE法可以直觀地分析出BSA與AP的共價偶聯(lián)效率，并可以實時地觀察到其二者的強烈物理吸附作用。

1 材料儀器與方法

1.1 實驗方法

1.1.1 AP合成

AP合成的方法參照文獻[6-7]，簡單描述如下：稱取2.7 g十二胺溶于100 mL四氫呋喃(THF)。稱取3.084 g聚異丁烯馬來酸酐放入圓底燒瓶中，將十二胺溶液倒入其中與聚異丁烯馬來酸酐混合，超聲處理使溶液變澄清，然后置于55-60 °C水浴攪拌1h，將THF蒸發(fā)使溶液濃縮到30-40 mL，此步是為了增強馬來酸酐環(huán)與十二胺氨基間的酰胺鍵生成效率。濃縮后的溶液在室溫下攪拌過夜，次日通過抽真空將溶液完全蒸干，加入40 mL氯仿攪拌，使瓶底附著的AP完全溶解。最終所得AP(圖1(b))結(jié)構(gòu)單元的濃度Cmonomer為0.5 mol·L-1。由于之后的應(yīng)用都在水溶液中，因此取100 μL AP將氯仿抽干，加入5 mL硼酸鈉緩沖液(pH=12)，劇烈攪拌，使AP完全溶解至一個透明澄清的溶液，所得AP單元結(jié)構(gòu)的濃度Cmonomer=0.01 mol·L-1。一條AP分子約有40個結(jié)構(gòu)單元，因此AP的濃度Cpolymer= 250μmol·L-1。

1.1.2 AuNP標(biāo)記AP

標(biāo)記的方法參照文獻[6-8]。簡要敘述如下：AuNP為實驗室自制的分散在有機溶劑中的疏水納米金顆粒。AuNP利用疏水作用標(biāo)記AP。AuNP的有效表面積為：

式中，deff為AuNP的有效直徑，約5 nm。

按AuNP有效表面積每平方納米加200個AP單體單元的比例將AuNP與AP混合，抽真空使有機溶劑氯仿?lián)]發(fā)直到混合物完全干燥。加入硼酸鈉緩沖液(50 mmol·L-1，pH=12)劇烈攪拌使溶液變澄清。這樣AuNP就標(biāo)記了AP。用2%瓊脂糖凝膠，40 V·cm-1電壓跑膠1 h，通過切膠回收去掉多余的未被AuNP標(biāo)記的AP。

1.1.3 BSA與AP的共價偶聯(lián)反應(yīng)

取PCR管編號1-12，首先在每個PCR管中加入10 μL超純水，取10 μL EDC儲存液加到12號PCR管中混勻。從12號PCR管中取出10 μL加入11號PCR管中混勻，再從11號PCR管中取出10 μL加入到10號管中混勻。以此類推，重復(fù)操作直到最后從1號PCR管中取出10 μL棄掉。12-1號管中EDC濃度依次被稀釋了一倍。再分別加入10 μL AP (AP:BSA=1:500)或10 μL AuNP標(biāo)記的AP與BSA混勻(AuNP:AP:BSA=1:25:500)，加入超純水將最終反應(yīng)體系固定為30μL。室溫下反應(yīng)3 h。AP與BSA利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl) carbodiimide hydrochloride, EDC)共價偶聯(lián)反應(yīng)的分子數(shù)配比見表1。

1.1.4 BSA與AP的物理吸附反應(yīng)

取PCR管編號1-12，首先在每個PCR管中加入10 μL超純水，取10 μL BSA儲存液加到12號PCR管中混勻。從12號PCR管中取出10 μL加入11號PCR管中混勻，再從11號PCR管中取出10 μL加入到10號管中混勻。以此類推，重復(fù)操作直到最后從1號PCR管中取出10 μL棄掉。12-1號管中BSA的分子數(shù)依次被減少了一倍。再分別加入10μL AP(AP=1)或AuNP標(biāo)記的AP (AuNP:AP= 1:25)與BSA混勻，加入超純水將最終反應(yīng)體系固定為30 μL。室溫下反應(yīng)30min。AP與BSA直接物理吸附反應(yīng)的分子數(shù)配比見表2。

表1 AP與BSA利用EDC共價偶聯(lián)反應(yīng)的分子數(shù)配比Table 1 Molar ratio of AP to BSA in EDC reaction.

表2 AP與BSA直接物理吸附反應(yīng)的分子數(shù)配比Table 2 Molar ratio of AP to BSA in the physical absorption experiments.

1.1.5 瓊脂糖凝膠水平電泳

所有樣品在電泳上樣前，加入10 μL CBB上樣緩沖液，混勻靜置30 min，讓CBB與BSA充分結(jié)合。之后用2%的瓊脂糖凝膠，0.5倍Tris-硼酸電泳(Tris/Borate/EDTA, TBE)緩沖液，40 V·cm-1電壓下跑膠1h。

2 材料儀器

CBB G-250 (≥80%，國藥)；瓊脂糖(Molecular Biology Grade, Invitrogen)；BSA (≥98%，Amresco)；本實驗中其它藥品均從Sigma-Aldrich公司購買。實驗中所用水一律為超純水（電導(dǎo)率≥18.2 mΩ，Millipore, Bedford, MA）。CBB儲存液配制：0.01 g CBB溶于5 mL超純水中，再加入5 mL甘油混勻，調(diào)節(jié)濃度到1.2 mmol·L-1。BSA儲存液配制：0.2 g BSA溶于5 mL超純水中，調(diào)節(jié)濃度到600 μmol·L-1；共價偶聯(lián)劑EDC儲存液配制：由于EDC易水解，所以采用現(xiàn)用現(xiàn)配，10 mg EDC溶于68.9 mL超純水中，調(diào)節(jié)濃度到768 mmol·L-1。實驗中所使用的電泳儀是百晶公司的多用途水平電泳儀(BG-subMIDI，35cm×15 cm×10 cm)配備一個百晶公司提供的專用電泳電源(BG-Power 600k)。

3 結(jié)果與討論

從分子結(jié)構(gòu)上看，CBB(圖1(a))與AP(圖1(b))分子在堿性緩沖液中由于磺酸基(-SO3-)與羧基(-COO-)的充分解離而都帶負(fù)電荷。CBB之所以能成為一種蛋白質(zhì)通用的染料[9]，是因為在生理緩沖液條件下，雖然大多數(shù)蛋白質(zhì)顯示出負(fù)電性（這也是蛋白質(zhì)自身維持其溶液穩(wěn)定性的保障），但是蛋白質(zhì)表面的側(cè)鏈帶正電荷的氨基酸殘基（如賴氨酸、精氨酸和組氨酸，圖2），在局部區(qū)域仍然可以與帶負(fù)電的CBB分子發(fā)生靜電相互作用。另外，由于CBB分子結(jié)構(gòu)中所含的6個苯環(huán)結(jié)構(gòu)可以與蛋白質(zhì)折疊過程中部分裸露的疏水區(qū)域發(fā)生疏水相互作用，并與芳香族氨基酸（如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）側(cè)鏈的苯環(huán)發(fā)生π-π堆積相互作用；這三種弱相互作用一起構(gòu)成了CBB與蛋白質(zhì)強烈吸附的驅(qū)動力。這種強烈的吸附作用也是本文開發(fā)預(yù)染色凝膠技術(shù)的核心思想。

圖1 CBB(a)與AP(b)分子結(jié)構(gòu)示意圖。由Chemoffice 2010軟件制作，圖1(b)只是AP分子的一段：4個單體單元（以馬來酸酐環(huán)作為一個單體單元來算），一個AP分子平均含有40個單體單元。Fig.1 Molecular structures of CBB (a) and AP (b) produced by Chemoffice 2010. Fig.1(b) only represents a fragment of AP. There are four monomer units (with one anhydride ring as a monomer unit). An AP molecule has an average of 40 monomer units.

圖2 BSA分子表面?zhèn)孺湈д姷陌被釟埢植际疽鈭D。由Cn3D軟件的Find Pattern功能產(chǎn)生。BSA分子的3D晶體結(jié)構(gòu)來自Pubmed網(wǎng)站提供的Structure功能。亮色標(biāo)記了帶氨基的氨基酸殘基：賴氨酸和精氨酸以及帶咪唑基的組氨酸殘基。(a) 正面，(b) 背面Fig.2 Distribution of positively charged amino acid residues on BSA surface produced by the Find Pattern function of Cn3D software. The 3D crystal structure of BSA obtained from the structure function of Pubmed website. The highlighted regions are amino acid residues with amino group: lysine and arginine, and histidine with imidazole group. (a) Front view, (b) Back view

AP近年來被廣泛應(yīng)用于疏水納米顆粒以及不溶性生物分子、藥物的包裹技術(shù)中[10]。通過AP的包裹，疏水的納米結(jié)構(gòu)、藥物分子等可以穩(wěn)定地溶解在生理緩沖體系中發(fā)揮作用，然而由于AP分子的強烈負(fù)電性和細(xì)胞內(nèi)及血液中過分擁擠的分子環(huán)境[11-13]，有時會使得預(yù)先設(shè)計的納米結(jié)構(gòu)表面吸附一層生物分子，從而遮蓋了原本設(shè)計的作用位點。另一方面，有時在一些生物醫(yī)學(xué)工程或者化學(xué)化工中需要將一些指定的生物分子鏈接到AP包裹的納米結(jié)構(gòu)表面，如基于酶聯(lián)免疫吸附法的納米技術(shù)通常需要將抗體分子共價或者物理吸附到具有超順磁性或者高量子產(chǎn)率的AP包裹的納米結(jié)構(gòu)上[14]，藥房可以買到的“早孕試紙”便是將抗體吸附到納米膠體金顆粒表面。基于這兩方面的考慮，研究蛋白質(zhì)分子與AP分子的吸附作用與共價偶聯(lián)效率將會變得不僅有益，而且還具有普遍性。

為了檢測CBB是否能夠直接用于PSGE，本文在電泳上樣緩沖液中混合了一定比例的CBB，并與即將進行電泳的樣品混合30 min，以期CBB與蛋白質(zhì)（選BSA為例）充分吸附。為使分離效果明顯，選用2%的瓊脂糖凝膠在40 V·cm-1的TBE緩沖液中跑膠1 h。由于預(yù)染色的效果，我們可以在白光下目睹、監(jiān)視樣品的跑膠全過程。同時，如果有問題的話，也可以及時停止或采取相應(yīng)的措施。這是在以往“后染色”實驗中無法體驗到的樂趣與便捷。為了讓PSGE更有實用價值，設(shè)計了一個較復(fù)雜的實驗，如分別檢測BSA與AP的共價偶聯(lián)效率和直接物理吸附情況。

一般情況下，AP分子在水溶液中會像蛋白質(zhì)一樣將其疏水的部分折疊到內(nèi)部，而將帶電的基團暴露于其表面，從而保持其能量最低狀態(tài)。然而由于AP分子的主鏈太短（圖1(b)，平均只有40個單體），這種情況下，會選擇將多個AP分子結(jié)合到一起自組裝成膠束(圖3(a))，這與很多表面活性劑相似。圖3(b)中從左到右各條泳道分別為：第1條泳道是純BSA，從第2條到第13條分別是表1中1-12號PCR管中的樣品。圖3(c)中從左到右各條泳道分別為：第1條泳道是純BSA，從第2條到第11條分別是表2中1-10號PCR管中樣品；所有圖3(b)和(c)中樣品都與等量的CBB混合30 min后，加樣到2%的瓊脂糖凝膠孔中，在40 V·cm-1的電場中跑膠1 h。由圖3(b)看出，隨著共價偶聯(lián)試劑EDC的增加，條帶越來越滯后，說明BSA與AP的共價偶聯(lián)與EDC的量成正相關(guān)。此塊瓊脂糖凝膠在電泳后保持非常好的“潔凈度”，用來染色的CBB幾乎沒有非特異的擴散，條帶很大程度上可以定性、甚至定量地說明BSA與AP分子的偶聯(lián)效率，展示出了預(yù)染色法的應(yīng)用開發(fā)潛力。

圖3 CBB直接染色法檢測BSA與AP膠束結(jié)合效率(a) BSA與AP膠束偶聯(lián)后被CBB染色的示意圖，(b) BSA與AP膠束利用交聯(lián)劑EDC共價偶聯(lián)的電泳結(jié)果，(c) BSA與AP膠束直接物理吸附的電泳結(jié)果Fig.3 Binding efficiency of BSA and AP detected by CBB pre-staining. (a) Schematic diagram of BSA coupled with AP micelles and pre-stained by CBB, (b) Gel electrophoresis result of BSA coupled with AP by EDC, (c) Gel electrophoresis result of BSA physically absorbing to AP micelles

因為利用CBB主要是針對蛋白質(zhì)BSA的染色，所以當(dāng)研究BSA與AP的偶聯(lián)或者吸附的效率時，并不能同時準(zhǔn)確地監(jiān)控到AP的“行蹤”，而同時了解BSA與AP的單體狀態(tài)也是非常有研究意義的（如對于結(jié)合常數(shù)的計算是必須的）。為此，我們利用膠體金納米顆粒（疏水顆粒，直徑5 nm）巧妙地標(biāo)記了AP分子形成的膠束（利用AP分子的包裹性能，如圖4(a)所示，包裹了疏水膠體金納米顆粒），從而可以做到同時定量監(jiān)視兩種反應(yīng)物質(zhì)的狀態(tài)。圖4(b)中從左到右各條泳道分別為：第1條泳道是純CBB，第2條泳道是純BSA，從第3條到第14條分別是表1中1-12號PCR管中的樣品；圖4(c)中從左到右各條泳道分別為：第1條泳道是純CBB，第2條是純BSA，從第3條到第14條分別是表2中1-10號PCR管中樣品；所有圖4(b)和(c)中樣品都與等量的CBB混合30 min后，加樣到2%的瓊脂糖凝膠孔中，在40 V·cm-1電場中跑膠1 h。如圖4(b)所示，如果光看第4-11條泳道的深色（CBB染色的BSA）形狀，幾乎與圖3(b)中第2-13條泳道所顯示的完全一樣，一定程度上說明了AuNP對AP的物理法標(biāo)記并沒有改變AP與BSA的相互作用。然而，如果我們只看AuNP顯示出的虛線框注的淺色，即可追蹤到AP分子的狀態(tài)：從圖4(b)的第4-11條泳道可以看出，隨著交聯(lián)劑EDC分子數(shù)的增加，由開始的自由的AP膠束和自由的BSA，逐漸發(fā)展到AP膠束與BSA共價偶聯(lián)到一起，由于復(fù)合物的粒徑變大，電荷減少，所以最終表現(xiàn)出條帶越來越滯后的現(xiàn)象。

圖4 AuNP標(biāo)記AP膠束檢測CBB直接染色法的可行性(a) BSA與AuNP標(biāo)記的AP偶聯(lián)后被CBB染色的示意圖，(b) BSA與AuNP標(biāo)記的AP膠束利用交聯(lián)劑EDC共價偶聯(lián)的電泳結(jié)果，(c) BSA與AuNP標(biāo)記的AP膠束直接物理吸附的電泳結(jié)果。虛線框內(nèi)的淺色是AuNPs。Fig.4 Feasibility of CBB pre-staining checked by AuNP-labeled AP micelles. (a) Schematic diagram of binding BSA with AuNP-labeled AP and pre-stained by CBB, (b) Gel electrophoresis result of BSA coupled with AuNP-labeled AP micelles by EDC, (c) Gel electrophoresis result of BSA physically absorbing to AuNP-labeled AP micelles. The light color outlined by dotted line are AuNPs.

需要補充說明的是，圖3(b)中每個條帶都有一個上部的“拖尾”，這個拖尾幾乎讓條帶展寬了一倍，我們知道這對于高分辨分析不利，所以有必要研究一下原因。首先想到的是CBB分子過飽和吸附導(dǎo)致部分CBB分子吸附作用太弱，在跑膠過程中脫離了BSA分子。對比圖3(b)的第1泳道、圖3(c)的第1泳道、圖4(b)的第2泳道、圖4(c)的第2泳道，不難發(fā)現(xiàn)這個理論可以解釋以上現(xiàn)象，因為在這幾塊電泳中逐漸降低了CBB分子的濃度，使得其避免了過飽和效應(yīng)導(dǎo)致的減弱結(jié)合力的效應(yīng)，從而在圖4(b)、(c)中幾乎看不到拖尾現(xiàn)象。同時，另外一個可能就是AP分子的疏水性也會與CBB有相互吸附的可能性。即便如此，從圖4(b)也可以得出，CBB與AuNP標(biāo)記的AP膠束吸附作用遠低于CBB與BSA的吸附作用，圖4(c)更清楚地佐證了CBB與BSA的吸附作用遠大于其與AP膠束的吸附作用。換句話說，當(dāng)有BSA存在的情況下，CBB與AuNP標(biāo)記的AP的吸附作用可以忽略不考慮，這點對于兩種物質(zhì)以上的反應(yīng)體系的實時監(jiān)測具有重要應(yīng)用開發(fā)價值。

為了進一步證實預(yù)染色法的應(yīng)用潛力，設(shè)計了利用此法監(jiān)控BSA與AP膠束的物理吸附作用。如圖3(c)所示，從第2-11條泳道可以看出，隨著BSA分子數(shù)的增加，深色的CBB逐漸被滯后，這是由于越來越多的BSA分子吸附到了AP膠束表面導(dǎo)致整個復(fù)合物尺度變大而造成的。然而，如果沒有圖4(c)的對比輔助分析，也許還不了解自由的AP膠束的狀態(tài)。通過對比圖3(c)與圖4(c)，同樣發(fā)現(xiàn)如果只看深色（不帶虛線框）的標(biāo)記所形成的形狀，幾乎完全相同；進一步說明了AuNP對自由AP膠束的標(biāo)記只是一種物理標(biāo)記，并不會影響其表面的化學(xué)吸附性能；而這種分別標(biāo)記的方法卻可以清晰地為我們展現(xiàn)出吸附反應(yīng)的進行狀態(tài)，也進一步顯示出CBB與AuNP對BSA和AP的染色互相沒有交叉污染的現(xiàn)象，這點更顯示出這種前雙染色法比前單染色法具有更高的應(yīng)用開發(fā)價值。

4 結(jié)語

本文開發(fā)了一種預(yù)染色方法，并證實了此法不僅可以代替常規(guī)的后染色法，而且還通過展示其在分析蛋白質(zhì)與兩性高分子聚合物共價偶聯(lián)與物理吸附反應(yīng)中的可行性、便捷性及實時監(jiān)控性等特點，充分說明了預(yù)染色法的巨大應(yīng)用潛力及開發(fā)價值。需要強調(diào)的是，通過前雙染色法與單染色法的對比，我們意識到這不僅是一種強大的研究手段，而且PSGE可以在不改變被分析/分離物的生化活性的前提下，實現(xiàn)通過物理作用介導(dǎo)的強結(jié)合力的染色效果。我們也期望本文所采用的AuNP標(biāo)記AP膠束的技術(shù)能對相關(guān)領(lǐng)域的科學(xué)家有“逆向思維”的啟發(fā)性。最后希望預(yù)染色技術(shù)在不久的將來可以擴展應(yīng)用到其它檢測、分析技術(shù)領(lǐng)域如層析技術(shù)。

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CLC TL271+.99

Research on pre-staining gel electrophoresis

ZHONG Ruibo LIU Yushuang ZHANG Ping LIU Jingran ZHAO Guofen ZHANG Feng
(College of Life Science, Inner Mongolia Agricultural University, Huhhot 010018, China)

Background: Gel electrophoresis is a powerful biochemical separation technique. Most biological molecules are completely transparent in the visible region of light, so it is necessary to use staining to show the results after gel electrophoresis, and the general steps of conventional staining methods are time-consuming. Purpose: We try to develop a novel approach to simplify the gel electrophoresis: Pre-Staining Gel Electrophoresis (PSGE), which can make the gel electrophoresis results monitored in real time. Methods: Pre-stain the protein samples with Coomassie Brilliant Blue (CBB) for 30 min before loading the sample into the gel well. Results and Conclusion: PSGE can be successfully used to analyze the binding efficiency of Bovine Serum Albumin (BSA) and amphiphilic polymer via chemical coupling and physical absorption, and the double PSGE also shows a great potential in bio-analytical chemistry.

Gel electrophoresis, Pre-staining, Covalent coupling, Physical absorption, Protein, Amphiphilic polymer

TL271+.99

10.11889/j.0253-3219.2014.hjs.37.070501

國家自然科學(xué)基金項目(No.21171086、No.81160213)、內(nèi)蒙古自治區(qū)草原英才工程項目(No.108-108038)、內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項目

(No.2013MS1121、No.211-202060)資助

鐘睿博，女，1987年出生，2009年畢業(yè)于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，現(xiàn)為碩士研究生

趙國芬，E-mail: guofenzhao@126.com；張峰，E-mail: fengzhanng1978@hotmail.com

2014-04-15，

2014-04-22