鄭新添，黃翠琴，黃其春，楊小燕，劉建奎

（龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，福建省人畜寄生與病毒性疫病防控工程技術(shù)研究中心，福建龍巖364012）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），又稱(chēng)“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種以母豬妊娠后期的早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙、新生仔豬的呼吸癥狀及仔豬的高死率為特征的高度接觸性傳染?。?］。PRRS是目前影響我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)的首要病毒性疫?。?］，近年來(lái)，以高致病性PRRSV變異株為主要病原的“豬高熱綜合征”給我國(guó)豬場(chǎng)造成嚴(yán)重的損失［3-4］?？焖僭\斷是控制PRRS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，目前PRRSV的檢測(cè)方法包括病毒分離與鑒定、RT-PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)、免疫熒光技術(shù)及血清學(xué)方法等［5］。但上述方法也存在一些不足，如病毒分離過(guò)程繁瑣，PCR檢測(cè)需要昂貴的設(shè)備，血清學(xué)診斷不能有效檢測(cè)病原，因此在臨床快速診斷特別是基層獸醫(yī)臨床檢測(cè)方面均難以滿(mǎn)足實(shí)際需要。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)依賴(lài)于Bst DNA聚合酶大片段的置換活性，4條特異性引物在65℃下就能對(duì)目標(biāo)基因在1h內(nèi)完成109～1010個(gè)拷貝擴(kuò)增，結(jié)果無(wú)需電泳即可通過(guò)肉眼觀察判斷，高特異性、高效性、快速、簡(jiǎn)便、易檢測(cè)等特點(diǎn)［6］。LAMP技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于人類(lèi)及動(dòng)植物細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌等病原體的檢測(cè)［7］。本研究建立了快速檢測(cè)PRRSV的LAMP技術(shù)，為PRRSV的檢測(cè)提供一種新的手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 PRRS活疫苗毒（JXA1-R株）及豬瘟活疫苗為齊魯動(dòng)物保健品有限公司產(chǎn)品；豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）等核酸，來(lái)自于預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定的陽(yáng)性病料。被檢臨床樣品共25份，采集自龍巖學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究所接診的豬只。患豬體溫39℃～41℃，厭食、精神不振、呼吸困難，懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎等，結(jié)合病理剖檢初步判斷為PRRS疑似病例，采集患豬肺、淋巴結(jié)、脾臟等組織于-70℃凍存?zhèn)錂z。

1.1.2 主要試劑 Bst DNA聚合酶大片段為New England Biolabs公司產(chǎn)品；Trizol、DNA Marker、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶等為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；SYBR GreenⅠ染料，甜菜堿 （betaine）為Sigma公司產(chǎn)品；組織基因組DNA提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank公布的PRRSV的ORF5基因（登錄號(hào)：DQ475162），對(duì)其保守片段應(yīng)用在線(xiàn)服務(wù)器 （https：//primerexplorer.jp/）設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物（表1），其中包括2條外引物F3和B3以及2條內(nèi)引物FIP和BIP，引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 LAMP引物Table 1 Primers of LAMP

1.2.2 核酸的提取及RNA的逆轉(zhuǎn)錄 PCV-2、PRV等病毒DNA的提取采用組織基因組DNA提取試劑盒提取，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。PRRSV疫苗、豬瘟疫苗及PRRS疑似病料的RNA提取采用Trizol法，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

cDNA合成反應(yīng)體系及程序如下：1.5mL離心管中加入M-MuLV 5×buffer 4μL，Rnase Inhibitor（40U/μL ）0.5 μL，M-MuLV Reverse Transcriptase（5U/μL）1μL，random primer 1μL，dNTPs（2.5mmol）1μL，RNA模板5μL，室溫下混勻后，42℃水浴1h，冰浴2min，10 000r/min離心30s，即得cDNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR法驗(yàn)證2條外引物的準(zhǔn)確性 配制25μL的反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物（F3＋B3）各0.5μL（20pmol/μL ），PRRSV cDNA 1μL，ddH2O 10.5μL。反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃30s，共循環(huán)30次；最后72℃5min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。對(duì)符合預(yù)期大小的擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。

1.2.4 LAMP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 建立20μL LAMP反應(yīng)體系，含外引物（F3、B3），內(nèi)引物（FIP、BIP）、Betaine、MgSO4、Bst DNA 聚 合 酶、dNTP、Thermopol buffer及PRRSV的cDNA模板等成分。在63℃～65℃下擴(kuò)增，80℃2min終止反應(yīng)。取3μL產(chǎn)物進(jìn)行20g/L瓊脂糖凝膠電泳，同時(shí)向LAMP產(chǎn)物中加入1μL SYBR GreenⅠ染料，肉眼觀察顏色變化。

1.2.5 LAMP特異性試驗(yàn) 采用優(yōu)化的反應(yīng)條件，用 CSFV、PCV-2、PRV 核酸作為對(duì)照，檢測(cè)LAMP反應(yīng)的特異性。

1.2.6 LAMP敏感性試驗(yàn) 將濃度為549ng/μL PRRSV的cDNA進(jìn)行10倍梯度稀釋使其濃度為8個(gè)梯度，分別為549、54.9、5.49ng/μL，549、54.9、5.49pg/μL，549、54.9fg/μL ，分 別 取 1μL 進(jìn) 行LAMP擴(kuò)增，以檢測(cè)LAMP的敏感性。

1.2.7 LAMP的臨床應(yīng)用 取臨床疑似PRRS病例，提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后分別用RTPCR法［8］及LAMP技術(shù)檢測(cè)，比較兩者的檢出率。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性驗(yàn)證

用LAMP的外引物F3和B3進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示（圖1），獲得與預(yù)期大小一致，約200bp的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序與目標(biāo)基因的同源性達(dá)99%，因此該P(yáng)CR擴(kuò)增的為目標(biāo)基因。

圖1 LAMP外引物的驗(yàn)證Fig.1 Verification of outer primers of LAMP

2.2 LAMP反應(yīng)體系的建立

對(duì)LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果表明，LAMP最優(yōu)體 系 為 20 μL，反 應(yīng) 液 含 0.2 μmol/L F3，0.2μmol/L B3，1.6μmol/L FIP，1.6μmol/L BIP，1mol/L Betaine，6mmol/L MgSO4，8UBst DNA聚 合 酶，1.6mmol/L dNTP 各 2μL，10×Thermopol buffer及PRRSV的cDNA模板各1μL，加滅菌蒸餾水補(bǔ)至20μL。反應(yīng)體系在65℃擴(kuò)增60min，然后80℃作用2min，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳呈梯狀條帶（圖2A），產(chǎn)物經(jīng)SYBR GreenⅠ顯色后呈綠色熒光，而陰性呈橙色（圖2B）。

圖2 LAMP反應(yīng)結(jié)果Fig.2 LAMP reaction results

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

以PCV-2、PRV及CSFV核酸為對(duì)照，在同等條件下進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，結(jié)果表明僅對(duì)PRRSV可擴(kuò)增出特異的梯狀條帶（圖3A）及LAMP產(chǎn)物顯示綠色（圖3B），而對(duì)照中的PCV-2、PRV及CSFV等均無(wú)擴(kuò)增，反應(yīng)液經(jīng)染色呈橙色。

圖3 LAMP特異性試驗(yàn)Fig.3 Specificity test of LAMP

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)濃度分別為54.9ng/μL～54.9fg/μL 的PRRSV cDNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，結(jié)果表明在54.9ng/μL～5.49pg/μL可觀察到擴(kuò)增條帶，因此，LAMP的檢測(cè)下限為5.49pg/μL（圖4）。

圖4 LAMP敏感性試驗(yàn)Fig.4 Sensitivity test of LAMP

2.5 臨床檢測(cè)結(jié)果

對(duì)25份臨床樣品分別用常規(guī)RT-PCR及LAMP檢測(cè)PRRSV，結(jié)果表明，普通PCR的檢出率為64%，LAMP的檢出率為72%，LAMP的檢出率高于普通PCR。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組包含9個(gè)ORF，其中ORF5基因編碼病毒的囊膜蛋白GP5。PRRSV存在至少2個(gè)基因型即美洲型和歐洲型，我國(guó)大陸流行的以美洲型為主。不同地方分離的美洲型PRRSV株ORF5基因核苷酸同源性高達(dá)95%以上［9］。PRRSV與豬瘟病毒、偽狂犬病毒、圓環(huán)病毒等混合感染十分常見(jiàn)［10-11］，在臨床和病理上，PRRS與非典型豬瘟等相似，診斷較為困難，尤其以亞臨床和慢性發(fā)病更為常見(jiàn)［12］。病原檢測(cè)是PRRS確診的重要依據(jù)，目前基于病原核酸的檢測(cè)方法，包括PCR（實(shí)時(shí)定量PCR及普通PCR等）、原位雜交等，但操作較為繁瑣，或設(shè)備昂貴等不足。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速的核酸擴(kuò)增技術(shù)，具有快速、靈敏，操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物病原體的檢測(cè)。

引物設(shè)計(jì)是LAMP擴(kuò)增的關(guān)鍵步驟。應(yīng)用在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件，可針對(duì)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)6條引物，目前LAMP反應(yīng)體系多以4條引物為主，即2條外引物（F3和B3）和2條內(nèi)引物（FIP、BIP），本研究針對(duì)PRRSV的ORF5保守基因設(shè)計(jì)了4條LAMP引物。與普通PCR用一對(duì)特異性引物擴(kuò)增目的基因相比，LAMP針對(duì)目的基因的6個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)4條特異性引物，因此其特異性更高。研究結(jié)果顯示，本研究建立的LAMP僅對(duì)目標(biāo)基因擴(kuò)增，而對(duì)其他病原體如豬瘟病毒、偽狂犬病病毒及圓環(huán)病毒等均無(wú)擴(kuò)增，顯示了良好的特異性。

對(duì)LAMP體系優(yōu)化試驗(yàn)表明，該擴(kuò)增體系反應(yīng)溫度在63℃～65℃擴(kuò)增結(jié)果無(wú)明顯差異，引物濃度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果有較大影響，當(dāng)外引物（F3、B3）與內(nèi)引物（FIP、BIP）濃度比為1∶8時(shí)擴(kuò)增效果較好；甜菜堿Betaine及Mg2＋的最優(yōu)濃度分別為1mol/L及6mmol/L。在LAMP的靈敏度評(píng)估上，采取cDNA為模板，結(jié)果顯示該LAMP的檢測(cè)下限達(dá)5.49pg/μL高于普通 RT-PCR檢測(cè)法［13］，與實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法靈敏度相當(dāng)。對(duì)25份臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果表明建立的LAMP檢測(cè)法比普通PCR法具有更更高的檢出率。

此外，LAMP反應(yīng)中，從dNTPs析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中鎂離子結(jié)合，能形成焦磷酸鎂沉淀物，出現(xiàn)渾濁沉淀，僅肉眼觀察也可判斷，該方法優(yōu)點(diǎn)是LAMP反應(yīng)結(jié)束后不需開(kāi)蓋操作，最大限度降低了污染的可能性，當(dāng)然在反應(yīng)結(jié)束后再添加SYBR GreenⅠ等染料更易于觀察結(jié)果。

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