王清華，趙文年，劉春菊，王淑娟，包靜月＊，王志亮＊

（1.中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島，266032；2新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830000）

小反芻獸疫（Peste des petits ruminants，PPR）是山羊、綿羊和野生小反芻獸的一種急性病毒病，以發(fā)熱，眼、鼻有分泌物，胃炎，腹瀉和肺炎為特征。PPR是一種地方性流行疫病，先后在非洲、中東和亞洲發(fā)生和流行。我國西藏阿里和那曲地區(qū)分別于2007年和2008年暴發(fā)小反芻獸疫［1］；2013年11月～12月，我國新疆暴發(fā)小反芻獸疫疫情。通過撲殺、大規(guī)模免疫、檢疫和移動控制、野生動物控制等綜合防控措施，上述疫情得到有效控制。

小反芻獸疫病毒（Peste des petits rumiants virus，PPRV）為單股負鏈RNA病毒，基因組大小為15 948個核苷酸，基因組3′末端為前導(dǎo)序列，5′末端為尾隨序列，6個編碼框基因排列順序為3′-N-P-MF-H-L-5′，依次編碼6個結(jié)構(gòu)蛋白，即核衣殼蛋白（N）、磷蛋白（P）、基質(zhì)蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝蛋白（H）和大蛋白（L），P基因還編碼2個非結(jié)構(gòu)蛋白C和V。P基因總長度為1 655個核苷酸，開放閱讀框長度為1 530個核苷酸，編碼509個氨基酸。P蛋白分子質(zhì)量約為54.8ku［2］，在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮作用。

本試驗利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，表達小反芻獸疫病毒西藏分離株Tibet 07的P蛋白，為進一步研究其生物學(xué)特性，研制特異性單抗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及細胞 大腸埃希菌DH10-BacTM、pFastBac/CT-TOPO載體以及昆蟲傳代細胞系sf 9為Invitrogen公司產(chǎn)品；大腸埃希菌DH 5α為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；pGEM-T載體為Promega公司產(chǎn)品；PPRV Tibet 07株cDNA、PPRV陽性血清由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心外來病研究中心保存。

1.1.2 主要試劑 sf 900TMⅢSFM 培養(yǎng)基、Foetac Bovine Serum為Gibco公司產(chǎn)品；各種工具酶為NEB公司產(chǎn)品；Thermo Scientific PageRuler Prestained Protein Ladder、DAB Substrate為 Thermo公司 產(chǎn) 品；Pent-HisTMAntibody、QIAprep○RSpin Minprep Kit、QIAquick○RGel Extraction Kit 為QIAGEN公司產(chǎn)品；Bac-to-Bac TOPO Cloning Kit、PCR SuperMix、CellfectionⅡ○RReagent、Zy-MAXTMRabbit Anti-Goat IgG（H＋L）-HRP、Rabbit Anti-Goat IgG-FITC、Triton X-100、CFM-PBS為Invitrogen公司產(chǎn)品；Genogure Plasmid Mid Kit、Expand High FidelityPlusPCR Stystem為Roche公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 P基因的PCR擴增及測序 根據(jù)Tibet 07毒株基因組序列設(shè)計擴增P基因的PCR引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，在上、下游引物中分別引入NcoⅠ和NotⅠ酶切位點，上游引物序列為：PF-NcoⅠ-bac 5′-CATGCCATGGCACCGATGGCAGAAGAACAAG-3′（下劃線部分為NcoⅠ酶切位點），下游引物序列為：PR-NotⅠ-bac 5′-AAATAT GCGGCCGCCGGGTGCTTGGCGAGAATT-3′（下劃線部分為NotⅠ酶切位點）。通過PCR從PPRV Tibet 07毒株cDNA中擴增P基因，擴增片段膠回收純化后與pGEM-T載體連接，得到重組質(zhì)粒pGEM-PPRV-P，雙酶切鑒定為陽性的克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。

1.2.2 重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建 用NcoⅠ和NotⅠ雙酶切pGEM-PPRV-P，補平末端，與pFastBac/CT-TOPO進行平末端連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸埃希菌DH 5α，PCR鑒定為陽性的克隆，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。測序正確的質(zhì)粒命名為pFastBacCT-PPRV-P。

1.2.3 Bacmid DNA的獲得 參考Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)（Invitrogen公司）技術(shù)手冊，取測序正確的重組穿梭質(zhì)粒pFastBacCT-PPRV-P轉(zhuǎn)化MAX Efficiency感受態(tài)大腸埃希菌DH10Bac，藍白斑篩選獲得陽性菌落，使用Genogure Plasmid Mid Kit（Roche）提取重組桿狀病毒DNA，經(jīng)PCR鑒定，獲得的重組桿粒命名為Bacmid-PPRV-P。

1.2.4 sf 9細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 用Sf 900ⅡSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)sf 9細胞，利用轉(zhuǎn)染試劑CellfectionⅡ用重組桿粒Bacmid-PPRV-P轉(zhuǎn)染sf 9細胞，當(dāng)細胞出現(xiàn)CPE時，收集細胞，500r/min離心5min，取上清，即為第1代重組桿狀病毒（P1），測定病毒滴度。

1.2.5 桿狀病毒的擴增 將P1代重組桿狀病毒以0.1moi感染sf 9細胞，72h后收獲P2代病毒，測定病毒滴度。將P2代病毒傳至P3代病毒，測定病毒滴度。

1.2.6 SDS-PAGE和 Western blot檢測目的蛋白的表達 將P3代重組桿狀病毒以5moi感染sf 9細胞（9×106cell/孔），27℃懸浮培養(yǎng)72h后，收獲細胞凍融裂解，離心取細胞裂解液，加上樣緩沖液后沸水煮5min，取樣以120g/L分離膠進行SDSPAGE分析。將電泳后凝膠上的蛋白采用半干法轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，用50g/L脫脂奶粉4℃封閉過夜。PPR陽性血清（1∶12 000稀釋）為一抗，兔抗山羊IgG-HRP（1∶10 000稀釋）為二抗，進行 Western blot鑒定，洗膜后用DBA顯色。

1.2.7 間接免疫熒光試驗 將P3代重組桿狀病毒感染sf 9細胞72h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗3次，用40g/L多聚甲醛室溫固定30min，PBS洗3次，用1g/L的Triton X-100通透15min，PBS洗3次，用10g/L BSA-PBS封閉30min，PBS洗3次。用抗PPRV陽性血清（1∶12 000稀釋）室溫孵育1h，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG（1∶70稀釋），室溫孵育1h，PBS洗3次，封片后在熒光顯微鏡下進行觀察。

2 結(jié)果

2.1 P基因的擴增和重組克隆質(zhì)粒的鑒定

P基因的擴增產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見約1 530bp的特異性片段。與預(yù)期結(jié)果相符，表明成功擴增了PPRV Tibet 07株的P基因。重組克隆質(zhì)粒pGEMT-PPRV-P經(jīng)NcoⅠ/NotⅠ雙酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳，可見約1 530bp的目的基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符。經(jīng)測序，發(fā)現(xiàn)序列與目的基因序列完全一致，表明成功構(gòu)建了pGEMPPRV-P載體（圖1）。

圖1 P基因的PCR擴增和重組克隆質(zhì)粒pGEM-PPRV-P的酶切鑒定（NcoⅠ/NotⅠ）結(jié)果Fig.1 PCR amplification of P gene and enzyme digestion identification of recombinant plasmid pGEM-PPRV-P

2.2 重組穿梭質(zhì)粒的鑒定

重組穿梭質(zhì)粒pFastBacCT-PPRV-P用P基因擴增引物進行PCR擴增，可見約1 530bp的特異性片段，結(jié)果與預(yù)期相符。經(jīng)測序，挑選方向正確且序列無突變的質(zhì)粒進行后續(xù)試驗。表明成功構(gòu)建了pFastBacCT-PPRV-P載體（圖2）。

2.3 重組桿粒的鑒定

重組桿粒Bacmid-PPRV-P用P基因擴增引物進行PCR擴增，可見約1 530bp的特異性片段，結(jié)果與預(yù)期相符。表明成功構(gòu)建了重組桿粒Bacmid-PPRV-P（圖3）。

圖2 pFastBacCT-PPRV-P的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of pFastBacCT-PPRV-P

圖3 Bacmid-PPRV-P的PCR鑒定Fig.3 PCR identification of Bacmid-PPRV-P

2.4 融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot結(jié)果

以5moi的P3代重組桿狀病毒感染sf 9細胞后的細胞裂解液經(jīng)120g/L分離膠的SDS-PAGE分析，可見分子質(zhì)量約54ku的目的條帶 （圖4A）。經(jīng)Western blot分析，在54ku處有特異性的印跡條帶，在正常的sf 9細胞中沒有該印跡條帶 （圖4B）。表明在昆蟲細胞中成功表達了PPRV Tibet 07株的P蛋白。

圖4 重組P蛋白的SDS-PAGE（A）和 Western blot（B）鑒定Fig.4 SDS-PAGE（A）and Western blot（B）analysis of the recombinant P protein

2.5 間接免疫熒光的結(jié)果

使用P3代重組桿狀病毒感染sf 9細胞，使用PPRV陽性血清做間接免疫熒光鑒定。由試驗結(jié)果可見（圖5），表達P蛋白的細胞具有特異性熒光信號，表明在昆蟲細胞中表達的目的蛋白具有抗原性，能與PPRV陽性血清特異性反應(yīng)。

圖5 重組P蛋白的間接免疫熒光鑒定Fig.5 Indirect immunofluorescence analysis of the recombinant P protein

3 討論

小反芻獸疫最早于1942年發(fā)生于西非。1970年-1972年，PPR首次在東非國家蘇丹發(fā)生，1983年傳至阿拉伯半島，1987年傳至印度南部。在非洲，PPR流行于中部和北部。在亞洲，PPR在中東、中亞和南部亞洲的大部分國家流行，對我國西南邊境省份形成包圍態(tài)勢［3］。2007年7月～9月，我國西藏首次暴發(fā)PPR疫情［4］。該疫情涉及西藏阿里地區(qū)革吉縣、日土縣、扎達縣和改則縣4個縣、10個鄉(xiāng)鎮(zhèn)、13個村，共出現(xiàn)20個疫點，羊發(fā)病6 122只，死亡1 888只［5］。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，2005年P(guān)PR可能就曾經(jīng)傳入與印度接壤的日土縣熱角村，但未被確診。PPR可能從印度傳入，在阿里境內(nèi)緩慢向東擴散［4］。2008年西藏阿里地區(qū)革吉縣文布當(dāng)桑鄉(xiāng)羅瑪村發(fā)生野生巖羊小反芻獸疫疫情，未見家畜發(fā)?。?］。2008年6月初，在那曲地區(qū)尼瑪縣雙湖區(qū)嘎措鄉(xiāng)發(fā)生PPR疫情。2010年5月，阿里地區(qū)日土縣多瑪鄉(xiāng)烏江村斯亞點發(fā)生PPR疫情。此后，西藏再無新的疫情報道。2013年11月～12月，新疆暴發(fā)PPR疫情，疫情確診后，被迅速撲滅。小反芻獸疫頻頻傳入我國，對我國西南邊境省份的養(yǎng)羊業(yè)構(gòu)成嚴重威脅，迫切需要在我國開展PPR相關(guān)的研究。

已有研究表明，PPRV的P蛋白在病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過程中發(fā)揮作用。副黏病毒P蛋白能與不同形式的N蛋白結(jié)合，也能單獨與N蛋白-RNA模板復(fù)合物結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄［7］。P蛋白與L蛋白相結(jié)合形成依賴于RNA的RNA聚合酶，然后與N蛋白-RNA模板結(jié)合形成核糖核蛋白復(fù)合體，進行病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制［8］。已有研究表明，麻疹病毒P蛋白在阻斷宿主干擾素反應(yīng)通路中發(fā)揮重要作用［9］。P蛋白主要通過阻斷Janus激酶1（JAK1）對信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）的磷酸化而干擾宿主的JAK/STAT通路，從而阻斷干擾素反應(yīng)。我國目前對小反芻獸疫病毒結(jié)構(gòu)蛋白的研究主要集中于H、N、M和F蛋白［10-13］，對P基因開展了毒株序列特性分析［2］，但是，還沒有關(guān)于P蛋白表達特性的研究報道。利用真核表達系統(tǒng)表達具有生物活性的PPRV P蛋白，對于進一步研制特異性單克隆抗體和研究其生物學(xué)特性具有重要意義。

桿狀病毒表達系統(tǒng)利用桿狀病毒作為載體，在昆蟲細胞中表達外源蛋白，其表達產(chǎn)物為有生物活性的可溶性蛋白。該系統(tǒng)對外源基因克隆容量大，重組病毒易于篩選，具有完備的翻譯后加工修飾系統(tǒng)，被廣泛應(yīng)用于病毒外源基因的高效表達，為研制亞單位疫苗和制備特異性抗原奠定了基礎(chǔ)［14-15］。本研究采用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達小反芻獸疫病毒西藏流行株P(guān)蛋白，通過Western blot和間接免疫熒光反應(yīng)證明得到的重組蛋白能與PPRV陽性血清發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，表明成功表達了P蛋白。在本研究中，由于目前沒有小反芻獸疫病毒P蛋白的特異性單克隆抗體，因此使用小反芻獸疫病毒陽性羊血清對重組P蛋白進行Western blot分析，結(jié)果除了目的條帶以外，可觀察到其他的印跡條帶，可能是羊血清中的一些成分與細胞蛋白發(fā)生了免疫反應(yīng)。本研究為進一步研究PPRV的P蛋白生物學(xué)特性，研制其單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。

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