唐金明，陳書琨，林慶燕，黃新亞，盧體康，孫 潔，阮周曦，曾少靈，祁振強，呂建強，楊俊興，曹琛福，張彩虹，劉建利，廖立珊，花群義，秦智鋒＊

（1.深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳518045；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，廣東廣州510642；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖南長沙410000；4.深圳市寶舜泰生物醫(yī)藥股份有限公司，廣東深圳市518001）

豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的一種急性、高度接觸性腸道傳染病，主要臨床表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、脫水和哺乳仔豬高致死率。PED呈世界范圍性流行，1971年在英國和比利首次報道，此后加拿大、匈牙利、德國、日本及韓國等多個國家都報道了該病的發(fā)生。中國于1976年首次報道PED［1］。最近幾年，PED危害性進一步加大，流行呈明顯上升趨勢［2-3］。從2010年春季至今，我國的很多省份、泰國、菲律賓、韓國及美國等國家的規(guī)模化豬場暴發(fā)嚴重的豬流行性腹瀉疫情。2013年，豬流行性腹瀉病毒已蔓延美國13個州，造成了嚴重的經(jīng)濟損失。PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、輪狀病毒A（Rotavirus group A，Rota-A）感染后所引起的臨床癥狀相似，臨床難以鑒別診斷，給疾病的確診、治療和防控帶來了很大困難，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重經(jīng)濟損失。

2013年，從規(guī)模化養(yǎng)豬場采集20多份臨床樣品，采用Vero-76細胞系分離出了1株P(guān)EDV，并通過RT-PCR方法和測序?qū)ζ溥M了鑒定。為建立PEDV的快速檢測方法，采用實時熒光定量RTPCR（real-time RT-PCR，rRT-PCR）技術(shù)建立一種能快速、靈敏、準確檢測PEDV的實時熒光定量RT-PCR檢測方法（PEDV-rRT-PCR），以達到提高檢測靈敏度、降低檢測成本、縮短檢驗周期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用病料及分組 來自廣東某豬場發(fā)生腹瀉、瀕臨死亡仔豬的小腸及內(nèi)容物、糞便，哺乳母豬的乳汁；豬傳染性胃腸炎華南毒株和豬流行性腹瀉PEDV-CV777毒株（為豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗），由哈爾濱獸醫(yī)研究所保存；Vero-76傳代細胞系（ATCC＃CRL-1587）為深圳出入境檢驗檢疫局動檢實驗室保存；DMEM營養(yǎng)液為GIBCO公司產(chǎn)品；胰蛋白酶（Trypsin）為Invitrogen公司產(chǎn)品。

1.1.2 試劑盒與儀器 One Step RNA PCR Kit為TaKaRa公司產(chǎn)品；AgPath-IDTMOne-Step RTPCR Kit為ABI公司產(chǎn)品；Qiagen Viral RNA Mini Kit為Qiagen公司產(chǎn)品；ABI 96孔普通PCR儀，ABI 7500HT熒光定量PCR儀，Qiagen EZ1advanced全自動核酸抽提工作站，BIO-RAD Hood II全自動凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 病毒鑒定引物 參照文獻［4］合成。P1：5′-TCGTTTTGGGTGGTTACCTAC-3′，P2：5＇-AGTGGCAAATACATTGGCAGCG-3′，由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.2.2 PEDV-rRT-PCR引物與探針的設(shè)計 參照GenBank中登錄的PEDV膜蛋白基因（M基因）進行序列比對分析，以Clusta 1方式進行比對，以M基因中最保守的寡核苷酸序列作為探針，在探針兩側(cè)保守區(qū)域設(shè)計特異性的、上下游引物，并在上游引物處設(shè)計了簡并引物，以避免漏檢。實時熒光定量RT-PCR引物探針，探針Pb：HEX-5′-TGTGGCGCAGGACAC-3′-BHQ，上 游 引 物 Fp：5′-GCATCCTTATGGC（T/C）TGCATCAC-3′，下游引物Rp：5′-TTCAGGATTGAAAGACCACCAAGAAT-3′，由上海基康生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.3 病毒分離鑒定

1.2.3.1 樣品處理 取發(fā)病小豬的小腸內(nèi)容物，用生理鹽水制成1∶10的懸浮液，于4℃以4000r/min離心20min，小心移去上層乳脂，取上清液經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，濾液分裝，置-80℃保存。

1.2.3.2 臨床樣品RT-PCR鑒定 參照 Qiagen Viral RNA Mini Kit操作說明書，于全自動核酸抽提工作站中抽提小腸內(nèi)容物等臨床樣品、陽性對照PEDV-CV777疫苗株和陰性對照（VERO-76細胞系）的核酸。采用文獻報道的P1和P2引物，參照TaKaRa公司一步法RT-PCR試劑盒說明書進行RT-PCR檢測。50μL RT-PCR反應(yīng)體系包含10×RT-PCR母液5μL、MgCl2（25mmol/L）10μL，dNTP Mixture（各10mmol/L）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq （5U/μL）1μL，P1（20μmol/L）1μL，P2（20μmol/L）1μL，樣品8μL，RNase Free dH2O 17μL。于ABI PCR儀進行擴增，反應(yīng)程序為：42℃50min，94℃10min，94℃1min，56℃50s，72℃1min，共35個循環(huán)；72℃10min。取10μL RT-PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，于BIO-RAD HoodⅡ全自動凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.2.3.3 病毒分離 按常規(guī)方法復(fù)蘇VERO-76細胞系，培養(yǎng)至單層，每瓶接種經(jīng)RT-PCR鑒定為陽性的可疑病料濾液1mL。同時接種經(jīng)TGEV標準陽性血清高濃度中和30min后的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉二聯(lián)活苗。接種病毒后的細胞37℃吸附1h，其間輕搖2次。吸附結(jié)束后，加入含有終濃度20μg/mL胰酶和含20mL/L胎牛血清的DMEM維持液，37℃培養(yǎng)72h作為一個傳代周期。傳代前，將上一次的細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，按上述方法進行盲傳，顯微鏡觀察細胞病變。每次細胞傳代后的病毒上清液，再次進行病毒RT-PCR鑒定。

1.2.4 PEDV-rRT-PCR檢測方法的建立

1.2.4.1 實時熒光 RT-PCR方法的建立 以PEDV-CV777毒株經(jīng)VERO-76細胞系培養(yǎng)傳代后的第3代細胞培養(yǎng)液為陽性對照，對小腸內(nèi)容物、第1代病毒細胞培養(yǎng)上清液和第3代病毒細胞上清液抽提核酸，核酸抽提見1.2.3.3。參照 ABI公司AgPath-IDK ht-Step RT-PCR Kit操作說明書建立PEDV熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系：每個25μL的反應(yīng)體系中包含2×RT-PCR母液12.5μL，酶混合物1μL，10μmol/L FP1μL，10μmol/L RP1μL，5μmol/L Pb1μL，無核酸酶的水3.5μL，RNA模板5μL，空白對照管中RNA模板用無RNase水代替。于ABI 7 500熒光PCR儀進行rRT-PCR擴增。反應(yīng)程序如下：50℃30min；95℃10min，95℃35s，60℃40s，共40個循環(huán)；60℃延伸時，收集熒光信號Hex。

將實時熒光定量RT-PCR擴增產(chǎn)物直接送寶生物工程（大連）有限公司進行克隆測序，將測序結(jié)果與GenBank公布序列進行比對分析。

1.2.4.2 PEDV-rRT-PCR檢測方法靈敏度試驗采用FP和RP引物，對PEDV-CV777毒株經(jīng)VERO-76細胞系培養(yǎng)傳代后的第3代細胞培養(yǎng)液抽提核酸，參照1.2.1.3進行RT-PCR擴增。用膠回收試劑盒回收電泳后的目的片段，再按照pMDTM19-T Vector Cloning Kit說明書與載體連接轉(zhuǎn)化。提取重組質(zhì)粒，通過測定質(zhì)粒DNA濃度來確定其拷貝數(shù)。將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA 10倍系列稀釋成10-3～10-86個稀釋度，按照1.2.4.1所建立的PEDV-rRT-PCR檢測方法進行靈敏度試驗，確定PEDV-rRT-PCR檢測方法的靈敏度。

1.2.4.3 PEDV-rRT-PCR檢測方法特異性試驗用所建立PEDV-rRT-PCR檢測方法，對病毒分離株第3代細胞培養(yǎng)上清液、PEDV-CV777毒株第3代細胞培養(yǎng)上清液等2份含PEDV的樣品和豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒、豬細小病毒、偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬肉組織、豬陰性血清樣品、大腸埃希菌、Vero-76細胞系等9份其他樣品進行檢測，進一步確定所建立方法的特異性。

1.2.4.4 PEDV-rRT-PCR檢測方法重復(fù)性試驗采用所建立的PEDV-rRT-PCR檢測方法，對PEDV第3代細胞培養(yǎng)物上清液原液和10-1稀釋液，分別抽提核酸后進行3次重復(fù)檢測，確定所建立方法的組內(nèi)差異。

1.2.4.5 田間小樣試驗 對自2012年開始，從3個大型豬場采集糞便、小腸和乳汁樣品共20份儲存樣品，用建立的方法進行PEDV的檢測，對所建立的方法進行田間小樣試驗。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離結(jié)果

將處理的樣品接種VERO-76細胞系，連續(xù)盲傳3代，顯微鏡下觀察每代細胞培養(yǎng)狀況。發(fā)現(xiàn)樣品接種細胞后，第1、2、3代均未出現(xiàn)細胞病變（Cytopathic Efect，CPE）。

2.2 PEDV RT-PCR檢測結(jié)果

以小腸內(nèi)容物、第3代PEDV細胞培養(yǎng)上清液、陽性對照PEDV-CV777疫苗株和陰性對照（VERO-76細胞系）為檢測對象，參照文獻建立的RT-PCR檢測方法，于PCR儀上進行PEDV的RT-PCR檢測。在陰性、陽性對照成立的情況下，2個樣品均出現(xiàn)特異性擴增條帶，條帶大小為584 bp，與預(yù)期大小一致（圖1）。

圖1 RT-PCR檢測PEDV結(jié)果Fig.1 The results of RT-PCR for PEDV detection

2.3 PEDV-rRT-PCR檢測結(jié)果

采用自行設(shè)計的PEDV特異性引物和探針，在25μL反應(yīng)體系中，于設(shè)定的反應(yīng)條件下進行實時熒光定量RT-PCR檢測。在陰性、陽性對照成立的情況下，小腸內(nèi)容物、第1代病毒細胞培養(yǎng)上清液和第3代病毒細胞上清液，均出現(xiàn)特異性實時擴增曲線，結(jié)果為陽性。檢測結(jié)果見圖2。

圖2 PEDV-rRT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 The detection results of PEDV-rRT-PCR

測序結(jié)果片段全長103bp，與GenBank中序列進行Blast比對分析表明，同源性達到98%。表明所建立的實時熒光定量RT-PCR擴增的目的片段為PEDV的M基因片段（測序圖略）。

2.4 PEDV-rRT-PCR檢測方法靈敏度試驗結(jié)果

將10倍系列稀釋的重組質(zhì)粒進行PEDV實時熒光定量RT-PCR檢測靈敏度測定。測定結(jié)果顯示，所建立的PEDV-rRT-PCR檢測方法的靈敏度為10-8（圖3），通過計算，相當于20個基因拷貝。

2.5 PEDV-rRT-PCR檢測方法特異性試驗結(jié)果

對2份PEDV第3代細胞培養(yǎng)上清液和9份非PEDV樣品進行PEDV-rRT-PCR檢測。結(jié)果顯示，2份PEDV樣品有陽性擴增曲線，其他9份非PEDV樣品沒有擴增曲線（圖4）。表明該方法特異性強，與其他檢測對象無交叉反應(yīng)。

圖3 PEDV-rRT-PCR檢測方法靈敏度結(jié)果Fig.3 Sensitivity of PEDV-rRT-PCR assay

2.6 PEDV-rRT-PCR檢測方法重復(fù)性試驗結(jié)果

用所建立的PEDV實時熒光定量RT-PCR檢測方法測定PEDV第3代細胞培養(yǎng)上清液原液和10-1稀釋液，3次重復(fù)度的組內(nèi)變異系數(shù)不大，在0.21～0.33，即組內(nèi)變異系數(shù)≤0.26%，符合檢測方法的要求。

圖4 PEDV-rRT-PCR檢測方法特異性結(jié)果Fig.4 Specificity of PEDV-rRT-PCR assay

2.7 田間試驗

對采集自2012年的3個大型豬場的豬糞便、小腸和乳汁等20份樣品，進行PEDV-rRT-PCR檢測。共篩選出17例陽性樣本。挑選其中4例樣本進行病毒的分離鑒定，再次進行檢測，檢測結(jié)果全部為PEDV。

3 討論

流行性腹瀉在多個國家流行，并有愈演愈烈的趨勢，各國都加強了對流行性腹瀉的監(jiān)控。但傳統(tǒng)的鑒別診斷方法，如病毒的抗原檢測、病毒的免疫電鏡觀察、病毒的分離與鑒定等，都需要十分煩瑣的病料前處理，工作量大、耗時長、操作復(fù)雜、診斷成本高。因此，建立一個操作簡單、靈敏度高、特異性強、檢測周期短的能夠廣泛運用的診斷方法顯得尤為迫切。實時熒光定量RT-PCR具有高靈敏度、高特異性、快速的特點，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)運于人醫(yī)的臨床檢測和獸醫(yī)的臨床診斷［5-6］，并且很多病毒的熒光PCR檢測方法都被列為了檢測標準，在豬流行性腹瀉方面也有相關(guān)研究［7-8］。針對此次突發(fā)的豬流行性腹瀉病毒危害極大的情況，本研究采用目前實驗室通用的實時熒光定量RT-PCR檢測技術(shù)，建立了豬流行性腹瀉病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法，為豬流行性腹瀉的實驗室快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過對小腸內(nèi)容物、病毒第1代細胞培養(yǎng)上清、病毒第3代細胞培養(yǎng)上清進行RT-PCR檢測，證實了從豬的小腸內(nèi)容物中分離到了一株流行性腹瀉病毒。據(jù)文獻報道［4］，豬流行性腹瀉具有一定的細胞毒性，很難在細胞系上傳代培養(yǎng)。本研究分離PEDV時，采用了Vero-76細胞系，加入了終濃度為20μg/mL胰酶，初步分離到了豬流行性腹瀉病毒。但在采用Vero-76細胞系進行第4代傳代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)病毒丟失現(xiàn)象。無論采用普通RT-PCR方法，還是采用所建立的PEDV-rRT-PCR檢測方法，均較難檢出PEDV。如何將PEDV進一步傳代，是需要進一步研究，進而為疫苗的快速制備提供前提和基礎(chǔ)。

自從1983年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)以來，由于其具有靈敏度高、特異性強的特點，PCR技術(shù)很快成為科研、臨床診斷、食品安全等各個領(lǐng)域的熱點技術(shù)。隨后各種核酸擴增技術(shù)不斷涌現(xiàn)，包括支鏈DNA檢測技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增技術(shù)、連接酶鏈技術(shù)和鏈置換擴增等核酸檢測技術(shù)也進行了一定程度的應(yīng)用。實時熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用最為廣泛，目前發(fā)展成為國際標準中新的“黃金標準”，主要用于各種病原體的診斷、病毒滴度監(jiān)測以及療效評估。本研究中所建立的PEDV實時熒光定量RT-PCR檢測方法靈敏度可以達到10-8，相當于20拷貝基因。與豬傳染性胃腸炎病毒、輪狀病毒等9份非PEDV樣品無任何交叉反應(yīng)，保證了檢測的特異性，有效解決了流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎難以鑒別診斷的問題。本研究中所建立的檢測方法靈敏度高，特異性好，且檢測周期短，適合用于豬流行性腹瀉病毒的分子生物學(xué)檢測和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。

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