李春曉 王彥坤 寧美英

1.國家衛(wèi)生計生委科學技術(shù)研究所藥物與醫(yī)用高分子材料中心（北京，100081）；2.北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院3.沈陽藥科大學研究生院

復方孕二烯酮陰道環(huán)的主要成分為孕二烯酮和炔雌醇，兩者聯(lián)用可用于女性避孕［1］。目前孕二烯酮市售藥物制劑為孕二烯酮和炔雌醇復方口服片劑。美國惠氏（Wyeth）公司生產(chǎn)的敏定偶，其與現(xiàn)代臨床常用的短效口服避孕藥相比具有明顯的臨床優(yōu)勢，已成為全球口服避孕藥的新寵。但是敏定偶（有效成份復方孕二烯酮）需每天不間斷服藥，漏服會明顯影響其避孕效果。本課題組制備的復方孕二烯酮陰道環(huán)［2-3］，可以實現(xiàn)恒定釋放藥物21d，能顯著提高服藥順應性。為了對復方陰道環(huán)的質(zhì)量進行控制，需要建立靈敏度高且專屬性好的孕二烯酮陰道環(huán)組分檢測方法。本研究按照中國藥典和相關化學藥物研究技術(shù)指導原則要求［4-7］，參照復方孕二烯酮片質(zhì)量標準（進口藥品復核標準匯編2001年，標準號JX20010079），對復方孕二烯酮陰道環(huán)組分進行了測定研究。建立并驗證了用于復方制劑中有關組分檢測的反相高效液相色譜（HPLC）法，為復方孕二烯酮陰道環(huán)制劑的體外質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters 2695型 HPLC（Waters公司，美國）；CLC-ODS型液相色譜柱（北京迪科馬科技有限公司）；SHZ-ST-A型水浴恒溫振蕩器（江蘇省金壇市朱林盛唐儀器廠）；X（S）K-160型開放式煉膠機（上海雙翼橡塑機械有限公司）；QLB-25D／Q型平板硫化機（上海雙翼橡塑機械有限公司）。孕二烯酮（北京紫竹天工科技有限公司，含量99.16%，批號T01520120201）；炔雌醇（北京紫竹天工科技有限公司，含量99.25%，批號 T00420120501）；聚維酮K30（國藥集團化學試劑有限公司，分析純，批號20101222）；乙 腈 （Fisher 公 司，色 譜 純，批 號112189）；甲醇（Fisher公司，色譜純，批號110939）。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -水（50：50，v／v）；檢測波長：GEST 239 nm，EE 205 nm；流速：1.0 ml／min；進樣量：100μl；柱溫：室溫。

1.3 溶液配制

對照品儲備液的配制：取孕二烯酮對照品14 mg，精密稱定，用乙腈-水（50：50，v／v）配制濃度為700 ng／ml的孕二烯酮對照品儲備液。另取炔雌醇對照品18 mg，精密稱定，用乙腈-水（50：50，v／v）配制濃度為360 ng／ml的炔雌醇對照品儲備液，于4℃冷藏，備用。供試品溶液的配制：取復方孕二烯酮陰道環(huán)（含孕二烯酮14 mg，炔雌醇1.8 mg），空白區(qū)段中間切斷，將孕二烯酮段與炔雌醇段分開，切碎（厚度0.5 mm）。分別置于裝有100 ml甲醇的錐形瓶中，室溫下磁力攪拌36 h后冰浴超聲2 h，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，孕二烯酮組取續(xù)濾液1.0 ml于10 ml容量瓶中，炔雌醇組取續(xù)濾液4.0 ml于10 ml量瓶中，用乙腈-水（50：50，v／v）稀釋至刻度，搖勻，分別作為孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液，于4℃冷藏，備用。自身對照溶液的配制：精密量取孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液各1.0 ml，分別置于100 ml量瓶中，用乙腈-水（50：50，v／v）稀釋至刻度，搖勻，得孕二烯酮、炔雌醇自身對照溶液，于4℃冷藏，備用。

1.4 專屬性試驗

1.4.1 空白干擾試驗 取處方量的空白陰道環(huán)碎片（厚度為0.5 mm）及輔料PVPK30，置于裝有100 ml甲醇的具塞錐形瓶中，冰浴超聲，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，取續(xù)濾液4.0 ml置于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，進樣分析，記錄色譜圖。

1.4.2 酸破壞 取陰道環(huán)孕二烯酮段和炔雌醇段，切碎（厚度0.5 mm），稱取適量（含孕二烯酮14 mg，炔雌醇1.8 mg），分別置于具塞錐形瓶中，一式3份，做備用樣品。加1 mol／L鹽酸溶液適量，于室溫放置24 h，加0.1 mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至中性，參照“1.3”項下操作，制備孕二烯酮、炔雌醇酸破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.3 堿破壞 備用樣品加1 mol／L氫氧化鈉溶液適量，于室溫放置24 h，加0.1 mol／L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，參照“1.3”項操作，制備孕二烯酮、炔雌醇堿破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.4 氧化破壞 備用樣品加3%過氧化氫試液適量，室溫放置8 h，參照“1.3”項操作，制備孕二烯酮、炔雌醇氧化破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.5 高溫破壞 備用樣品于60℃烘箱中放置24 h后取出，放至室溫，參照“1.3”項操作，制備孕二烯酮、炔雌醇高溫破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.4.6 光照破壞 備用樣品分別于（4500±500）Lx光照條件下放置48 h，參照“1.3”項操作，制備孕二烯酮、炔雌醇光照破壞供試品溶液，搖勻待測。

1.5 檢測限

分別將孕二烯酮、炔雌醇對照品儲備液進行稀釋，在“1.2”項色譜條件下，按信噪比（S／N）3：1計算檢出限。

1.6 重復性試驗

按“1.3”項方法分別平行制備孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液及自身對照溶液各6份，在“1.2”項色譜條件下進樣分析。按主成分自身對照法計算兩藥未知雜質(zhì)含量。

1.7 溶液穩(wěn)定性試驗

取“1.3”項下孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液，照“1.2”項色譜條件，分別于0、4、8、12、24 h進樣，記錄各峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。

1.8 有關物質(zhì)檢查

取3批復方孕二烯酮陰道環(huán)，按“1.3”項操作，制備孕二烯酮、炔雌醇供試品溶液及自身對照溶液，按“1.2”項色譜條件，分別精密量取兩藥自身對照溶液100μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對照液各100μl，分別進樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，用自身對照法計算雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗

2.1.1 空白干擾試驗 孕二烯酮和炔雌醇檢測條件下輔料的HPLC圖譜見圖1。結(jié)果顯示，在相應保留時間無其他峰出現(xiàn)，空白硅橡膠載體及輔料不干擾孕二烯酮及炔雌醇有關物質(zhì)測定。

2.1.2 強制降解試驗 強制降解試驗結(jié)果見圖2、圖3。圖譜中顯示，樣品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后藥物略有降解，各降解產(chǎn)物峰與兩主藥峰之間均可達到良好分離。

2.2 檢測限

由色譜分析結(jié)果可知，孕二烯酮和炔雌醇的檢測限分別為4 ng／ml和5 ng／ml。

2.3 重復性試驗

6 份供試品溶液中孕二烯酮和炔雌醇雜質(zhì)總和的RSD分別為1.6%和1.3%，方法重復性良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性試驗

孕二烯酮及炔雌醇在24 h內(nèi)雜質(zhì)峰面積總和RSD分別為1.4%和0.9%。兩藥供試品溶液在24 h內(nèi)均基本穩(wěn)定。

2.5 有關物質(zhì)檢查

3 批樣品測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示所制備的3批樣品分別在孕二烯酮及炔雌醇檢測條件下的單雜、總雜均＜0.5%。

圖1 孕二烯酮（A）和炔雌醇（B）檢測條件下輔料的HPLC圖譜

圖2 陰道環(huán)中孕二烯酮在未處理（A）、酸（B）、堿（C）、氧化（D）、高溫（E）、光照（F）條件下的 HPLC圖譜（t1／2＝11.71 min）

圖3 陰道環(huán)中炔雌醇在未處理（A）、酸（B）、堿（C）、氧化（D）、高溫（E）、光照（F）條件下的 HPLC圖譜（t1／2＝9.86 min）

表1 復方孕二烯酮陰道環(huán)中有關物質(zhì)的檢測結(jié)果

3 討論

復方孕二烯酮片質(zhì)量標準中采用高效液相色譜法對兩藥同時進行有關物質(zhì)檢查及含量測定，色譜條件如下，色譜柱為C18柱，流動相為乙腈-水（40：60，v／v），檢測波長為215 nm。本研究參考此標準，重新對HPLC方法進行了摸索。鑒于實驗室所用高效液相色譜儀為 Waters 2695型，配備 Waters 2487型雙通道紫外檢測器，根據(jù)紫外掃描結(jié)果，將孕二烯酮與炔雌醇檢測波長分別設定為239 nm和205 nm。方法建立之初對流動相組成進行了考察，嘗試采用甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水為流動相，由于炔雌醇檢測波長處于末端吸收，乙腈較甲醇截止波長低，且乙腈分離具有選擇性好、柱壓低、改善峰形等優(yōu)點，故有機相選擇乙腈；同時對流動相配比進行了考察，發(fā)現(xiàn)當配比為50：50時，峰形及保留時間最佳；最后對炔雌醇205 nm、210 nm和215 nm不同波長進行了考察，由于其釋藥量較低，最終選擇響應最大的205 nm作為其檢測波長。

本研究采用不加校正因子的主成分自身對照法對復方孕二烯酮陰道環(huán)中的有關物質(zhì)進行檢測和定量，專屬性試驗結(jié)果表明，孕二烯酮及炔雌醇能夠與降解產(chǎn)物完全分離，輔料不干擾主藥的測定。試驗結(jié)果表明該HPLC專屬性強，靈敏度高，可以用于復方孕二烯酮陰道環(huán)中有關組分的測定。

復方孕二烯酮陰道環(huán)有關組分的測定方法國內(nèi)外未見報道，本文在復方孕二烯酮片的含量測定方法基礎之上優(yōu)化了檢測波長，將HPLC法用于復方孕二烯酮陰道環(huán)有關組分的檢測，經(jīng)方法學驗證專屬性強，符合相關要求，可為復方孕二烯酮陰道環(huán)質(zhì)量標準的制訂提供科學依據(jù)。

［1］ 趙爽，鄭建華.第3代孕激素口服避孕藥的種類與應用［J］.實用婦科與產(chǎn)科雜志，2005，21（1）：6-8.

［2］ 李春曉，王彥坤，寧美英.孕二烯酮儲庫型陰道環(huán)的制備及釋藥機制的研究［J］.藥學學報，2014，49（3）：399-405.

［3］ 王彥坤，劉穎，李春曉，等.復方孕二烯酮陰道環(huán)的制備及體外釋放［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2014，34（14）：1171-1176.

［4］ 張玉琥.化學藥物復方制劑雜質(zhì)研究的特點及基本思路［J］.中國新藥雜志，2006，15（16）：1327-1329.

［5］ 張震，張玉琥.化學藥品復方制劑中有關物質(zhì)的定性歸屬方法［J］.中國新藥雜志，2008，17（21）：1898-1900.

［6］ 《化學藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導原則》課題研究組.化學藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導原則［R］.2005.

［7］ ICH指導委員會編.ICH藥品注冊的國際技術(shù)要求［M］，周海均譯.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.