劉青青, 牛玉娜, 周正宇, 王 婧, 盧明康, 薛智謀

(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 蘇州 215123)

小鼠生物凈化中的動(dòng)情周期判定及超數(shù)排卵

劉青青, 牛玉娜, 周正宇, 王 婧, 盧明康, 薛智謀

(蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 蘇州 215123)

目的 準(zhǔn)確判定小鼠動(dòng)情周期的變化，并在動(dòng)情周期的不同階段誘導(dǎo)超數(shù)排卵，探索最佳的超排時(shí)間，以提高生物凈化的成功率。方法 C57BL/6J小鼠每日08∶00至13∶00，取陰道脫落細(xì)胞進(jìn)行涂片，觀察脫落細(xì)胞中白細(xì)胞、有核細(xì)胞和角質(zhì)化細(xì)胞的比例及變化的規(guī)律，確定小鼠的動(dòng)情周期。據(jù)判定的動(dòng)情周期的各階段，腹腔注射外源激素分別誘導(dǎo)超數(shù)排卵后，于輸卵管中取卵母細(xì)胞計(jì)數(shù)，并統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果 根據(jù)陰道涂片確定小鼠動(dòng)情前期(包括過渡期)、動(dòng)情期(I、II期)、動(dòng)情后期和間情期。4～6周齡C57BL/6J小鼠誘導(dǎo)超數(shù)排卵的最佳時(shí)期是動(dòng)情前期，平均可獲得23.20枚卵母細(xì)胞,顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(P＜0.001)。結(jié)論 據(jù)陰道涂片觀察,C57BL/6J小鼠單個(gè)動(dòng)情周期持續(xù)4～10d，動(dòng)情周期內(nèi)不同時(shí)間段超排效果也不同。

小鼠; 動(dòng)情周期; 陰道涂片; 超數(shù)排卵

雌性小鼠性成熟后,生殖器官在激素的誘導(dǎo)下發(fā)生增生及至退化的周期性變化為動(dòng)情周期。大多數(shù)文獻(xiàn)認(rèn)為小鼠動(dòng)情周期一般為4～5 d，并將其劃分為動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期和間情期四個(gè)階段[1～3]。目前, 文獻(xiàn)上描述較多的判定小鼠動(dòng)情周期的方法有外陰直接觀察法、陰道栓觀察法和陰道脫落細(xì)胞涂片法三種[4～5]。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn), 小鼠動(dòng)情周期各階段的外陰變化并如文獻(xiàn)描述那么典型而且僅能判斷出小鼠處于動(dòng)情前期和動(dòng)情期(雌鼠接受雄鼠交配)，對(duì)于需要體外受精的實(shí)驗(yàn)并不完全適用。陰道涂片法判定小鼠的動(dòng)情周期簡單、準(zhǔn)確，大多數(shù)有關(guān)小鼠生殖生理的文獻(xiàn)也都提及了這個(gè)方法，但對(duì)操作方法和判定標(biāo)準(zhǔn)描述不夠詳盡。另外，不少文獻(xiàn)在涂片后進(jìn)行染色，而在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，沖洗染料的過程中，難免有細(xì)胞被洗掉, 導(dǎo)致判斷失誤, 且在樣本量較多時(shí), 步驟繁瑣, 費(fèi)時(shí)費(fèi)力。作者初期實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明, 由于未考慮小鼠動(dòng)情周期的變化直接進(jìn)行超數(shù)排卵，僅少數(shù)小鼠超排是成功的，大部分小鼠超排效果不明顯。基于此，本實(shí)驗(yàn)選取4～6周齡雌性C57BL/6J小鼠, 對(duì)其進(jìn)行連續(xù)20 d的陰道脫落細(xì)胞的觀察。在此基礎(chǔ)上分別在不同動(dòng)情階段誘導(dǎo)超排，對(duì)探索最佳的超排誘導(dǎo)時(shí)期和增加小鼠的排卵數(shù)具有指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雌性SPF級(jí)C57BL/6J 小鼠39只，4～6周齡，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(滬) 2007-0005]

1.2 主要試劑、儀器

0.9%的生理鹽水、PMSG和 hCG(寧波市三生藥業(yè)有限公司)、透明質(zhì)酸酶(Sigma)、75%酒精、O lympus倒置顯微鏡、O lympus解剖體視鏡、手術(shù)器械、微量移液槍、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、60mm培養(yǎng)皿、1 m l 注射器

1.3 方法

1.3.1 陰道涂片 10只4～6周齡的雌性C57BL/6J小鼠, 每日8∶00～13∶00, 用微量移液槍吸取100 μl生理鹽水，槍頭輕觸陰道口并注入陰道中，待回流時(shí)回吸，重復(fù)兩三次后，液體置入96孔板中，顯微鏡下觀察并判定動(dòng)情周期。

1.3.2 誘導(dǎo)超數(shù)排卵 另29只4～6周齡C57BL/6J小鼠，對(duì)其進(jìn)行陰道涂片觀察后分為5組: 對(duì)照組(自然排卵組)、動(dòng)情前期組、動(dòng)情期組、動(dòng)情后期組、間情期組。除對(duì)照組外，其他組分別在相應(yīng)時(shí)期誘導(dǎo)超數(shù)排卵。第1日17∶00，腹腔注射10 U的PMSG, 46～48 h后再腹腔注射10 U的hCG。注射hCG 20～23 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，輸卵管灌洗取出卵母細(xì)胞[6～7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和One-Way ANOVA。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)情周期各階段陰道脫落細(xì)胞的特點(diǎn)

間情期向前期的過渡期: 相比間情期, 細(xì)胞總體數(shù)量下降, 最明顯表現(xiàn)為白細(xì)胞大量減少, 圓形或橢圓形有核細(xì)胞明顯可見，并且數(shù)目逐漸增多(圖1A)。動(dòng)情前期: 白細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步減少, 有圓形或橢圓的有核細(xì)胞, 少或無多邊形的角質(zhì)細(xì)胞, 偶見退化的卵母細(xì)胞。常有粘附大量白細(xì)胞團(tuán)的黏液(圖1B)。動(dòng)情期I: 即排卵日, 無白細(xì)胞, 有少量的有核細(xì)胞, 數(shù)量相對(duì)于上一周期開始減少, 多為多邊形的角質(zhì)細(xì)胞。這是最佳的取卵母細(xì)胞的時(shí)期, 此時(shí)卵母細(xì)胞團(tuán)攢集于壺腹部(圖1C)。動(dòng)情期II: 即排卵后, 僅存在單個(gè)或片狀的攢集的以及少量的竹葉狀的角質(zhì)細(xì)胞(圖1D)。動(dòng)情后期: 細(xì)胞總數(shù)增加, 存在多邊形的角質(zhì)細(xì)胞, 白細(xì)胞開始出現(xiàn)并逐漸增多; 在取陰道脫落細(xì)胞的時(shí)候，常見到白色碎片狀分泌物貼滿陰道內(nèi)表面或半填滿陰道腔(圖1E)。間情期:此時(shí)細(xì)胞總數(shù)最多，鏡下幾乎全是白細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)準(zhǔn)焦螺旋能看到極少量的有核細(xì)胞，也是動(dòng)情周期中有核細(xì)胞出現(xiàn)的起始，但并不明顯(圖1F)。

2.2 超數(shù)排卵時(shí)期的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示, 動(dòng)情前期組小鼠取到的卵母細(xì)胞數(shù)目比其他組小鼠多近1倍(P＜0.001); 動(dòng)情期組小鼠取到的卵母細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05); 間情期誘導(dǎo)超排的小鼠卵母細(xì)胞數(shù)目相較于對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 討論

近年來，大量基因工程小鼠從國外引進(jìn)，在進(jìn)入SPF級(jí)設(shè)施前通常要經(jīng)過隔離檢疫，如果發(fā)生污染，一般可通過剖宮產(chǎn)[8]和胚胎移植[9]等方法進(jìn)行生物凈化。

圖1 小鼠動(dòng)情周期各階段的典型陰道脫落細(xì)胞涂片(×200)

表1 動(dòng)情周期的不同階段誘導(dǎo)超排獲取的卵母細(xì)胞數(shù)

準(zhǔn)確把握剖宮產(chǎn)時(shí)機(jī)，對(duì)小鼠見陰栓時(shí)間的判定要精確。對(duì)于無陰栓或陰栓不明顯的，應(yīng)根據(jù)陰道脫落細(xì)胞涂片中是否有精子作為小鼠是否成功交配的依據(jù)。剖宮產(chǎn)時(shí)間與仔鼠存活率密切相關(guān)，越接近母鼠自然分娩的時(shí)間，仔鼠成活率越高。在動(dòng)情期(I、II期)見陰栓的小鼠，通常在見陰栓18.5 d時(shí)，實(shí)施剖宮產(chǎn)。早于妊娠18.5 d則小鼠體質(zhì)弱，生存率低; 晚于18.5 d則小鼠可能出現(xiàn)順產(chǎn)，達(dá)不到凈化目的。而動(dòng)情前期見陰栓的小鼠，在18.5 d時(shí)剖宮產(chǎn)發(fā)現(xiàn)70%甚至全部仔鼠在代乳后1 d死亡，需要延遲1d實(shí)施剖宮產(chǎn)。

胚胎移植通常需要足夠多的受精卵，而常用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型的C57BL/6J小鼠正常排卵數(shù)較少(3.5 d的囊胚數(shù)約3～8枚)，一般均需進(jìn)行超數(shù)排卵才能獲取足夠的囊胚。超數(shù)排卵的效果主要受到小鼠日齡、動(dòng)情周期、生理和營養(yǎng)狀態(tài)、光照周期的影響，并且與動(dòng)情周期密切相關(guān)[6,10]。4～6周齡小鼠超排除在動(dòng)情前期達(dá)到最佳效果外，在動(dòng)情期超排卵母細(xì)胞數(shù)量也有一定比例的增多?？赡苁切∈髣?dòng)情周期天數(shù)的不同，有的小鼠動(dòng)情周期短，在動(dòng)情期使用外源激素誘導(dǎo)超排能在下一個(gè)動(dòng)情周期內(nèi)源激素升高前起作用。間情期誘導(dǎo)超排，獲取的卵母細(xì)胞中異形的、不正常的卵母細(xì)胞多于其他組，這和 Tarin等[11]研究的結(jié)果一致。

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Q95-33

B

1674-5817(2014)01-0056-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.012

2013-05-20

劉青青(1988-), 女, 碩士研究生, 研究方向: 轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立, E-mail: lsjj619@126.com

薛智謀, 教授, 從事人類疾病動(dòng)物模型的研究, E-mail:smcxzm@263.net