毛棟森, 陳 勤, 余陳歡, 胡毅翔, 張才喬

(1. 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 杭州 310013; 3. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院, 杭州 310009)

新橙皮苷二氫查爾酮對(duì)流感病毒誘導(dǎo)小鼠肺氣血屏障損傷的保護(hù)作用

毛棟森1,2, 陳 勤3, 余陳歡2, 胡毅翔2, 張才喬1

(1. 浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058; 2. 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院, 杭州 310013; 3. 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院, 杭州 310009)

目的 探討新橙皮苷二氫查爾酮(NHDC)對(duì)流感病毒誘導(dǎo)小鼠肺氣血屏障損傷的保護(hù)作用。方法 建立流感病毒感染小鼠肺炎模型，給予NHDC灌胃治療。計(jì)算小鼠肺指數(shù)、濕干比值、肺組織切片HE染色觀察其病理形態(tài)變化，ELISA法檢測(cè)感染后第6天血清中IL-6、LTB4和ICAM-1的含量。免疫組化法檢測(cè)肺組織水通道蛋白5(AQP5)蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 流感病毒感染小鼠肺指數(shù)和濕干比值明顯升高、肺組織間質(zhì)炎性細(xì)胞滲出，以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主，伴明顯的肺泡充血、水腫，肺組織AQP5蛋白表達(dá)水平明顯下降;而NHDC可明顯逆轉(zhuǎn)上述病理癥狀。結(jié)論 NHDC對(duì)流感病毒誘導(dǎo)的小鼠肺組織氣血屏障損傷有明顯的保護(hù)作用，其可能是通過上調(diào)AQP5蛋白表達(dá)而發(fā)揮作用。

新橙皮苷二氫查爾酮(NHDC); 流感病毒; 氣血屏障損傷; 水通道蛋白5(AQP5)

流感是一種高傳染性的常見呼吸道疾病，可引起嚴(yán)重的肺部感染，誘導(dǎo)急性肺損傷，甚至發(fā)展形成急性呼吸窘迫綜合征從而引起極高的死亡率。在流感病毒誘導(dǎo)的一系列病理生理改變過程中，肺氣血屏障功能缺陷居于中心地位[1]。氣血屏障的破壞將導(dǎo)致液體、蛋白、炎性介質(zhì)進(jìn)入肺泡腔，是流感病毒造成急性肺損傷主要的病理基礎(chǔ)。水通道蛋白(AQPs)是近年來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境水液代謝平衡的關(guān)鍵蛋白。其中，AQP5主要表達(dá)在I型肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上，定位于肺氣血屏障兩側(cè)，可介導(dǎo)水分子通過肺氣血屏障，對(duì)改善流感病毒誘導(dǎo)的滲透性肺水腫等病理癥狀發(fā)揮著重要作用，是肺臟通調(diào)水液轉(zhuǎn)運(yùn)的生理基礎(chǔ)[2]。目前尚缺少具有抗病毒及抑制肺水腫雙重療效以達(dá)到標(biāo)本兼治的的化學(xué)藥。新橙皮苷二氫查爾酮(NHDC)是從蕓香科植物中提取得到的新橙皮苷氫化而成的黃酮類衍生物[3]。近年來研究表明，其具有抗氧化、降血糖、抗肝纖維化等多種藥理活性，且無明顯的毒副作用[4～6]。項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)，NHDC具有潛在的抗炎和抗病毒活性，可降低流感病毒誘導(dǎo)的肺組織炎癥浸潤(rùn)和肺水腫，提示其可改善流感病毒誘導(dǎo)的肺氣血屏障損傷[7]。但其具體的藥效作用及作用靶點(diǎn)尚不清楚，故本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以肺臟水液代謝和氣血屏障功能的指標(biāo)蛋白AQP5為切入點(diǎn)，觀察NHDC對(duì)流感病毒誘導(dǎo)小鼠肺損傷的影響，以及對(duì)AQP5表達(dá)的調(diào)控作用，為NHDC的臨床應(yīng)用和抗流感病毒藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

新橙皮苷二氫查爾酮(批號(hào): 30702, 純度=98%),西安開來生物工程有限公司; 利巴韋林泡騰片(批號(hào): 091210), 浙江艾康禮德制藥有限公司。免疫組化試劑盒和DAB顯色盒購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。Class II Type/A/B2生物安全柜: 美國(guó)Beker公司。DC300萊卡圖像處理顯微鏡, 德國(guó)萊卡公司。

1.2 病毒株

甲型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株A/PR/8/34, 由浙江省疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。病毒效價(jià)為1∶512。本實(shí)驗(yàn)在浙江省疾病預(yù)防控制中心ABSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.3 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)ICR小鼠，雌雄各半，18～22g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(浙) 2008-0033]。按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組: 正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、利巴韋林給藥組(75 mg/kg)和NHDC高劑量給藥組(400 mg/kg)、NHDC中劑量給藥組(200 mg/kg), NHDC低劑量給藥組(100 mg/kg)，每組10只[SYXK (浙)2008-0113]。

1.4 流感病毒半數(shù)致死量的測(cè)定

將收集的流感病毒原液(雞胚尿囊液)10倍梯度稀釋，得到10-1、10-2、10-3、10-4、10-5濃度的病毒液。取ICR小鼠50只，采用單純隨機(jī)抽樣法，隨機(jī)平均分成5組，每組10只。每只小鼠經(jīng)乙醚輕度麻醉后分別滴鼻感染不同稀釋度病毒液25 μl。記錄感染后14 d內(nèi)小鼠自主行為、死亡時(shí)間、死亡數(shù), 第14日不死亡的，按14日計(jì)算, 感染24 h內(nèi)死亡的視為非感染死亡。計(jì)算各病毒感染劑量下的小鼠死亡率及流感病毒半數(shù)致死量(LD50)[7,8]。

1.5 模型建立及給藥

除正常對(duì)照組給予等劑量生理鹽水滴鼻外，其余各組在乙醚輕度麻醉下以10 LD50病毒量滴鼻感染小鼠, 30 μl/只。于感染后24 h開始灌胃給藥[7]。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組在同等條件下給予生理鹽水灌胃，每日1次，連續(xù)4 d。

1.6 取材及保存

于末次給藥后禁食禁水8 h，稱重，摘眼球取血后處死，迅速取肺組織，用生理鹽水洗凈并用無菌濾紙吸干后稱全肺重，并計(jì)算肺指數(shù)及肺指數(shù)抑制率[9]。取左側(cè)肺葉稱濕量(W)，80℃烘箱中烘烤48 h后稱干量(D)，計(jì)算肺組織W/D比值[8]。取右側(cè)肺組織10%福爾馬林液固定，用于HE染色和免疫組化分析。

1.7 血清炎性介質(zhì)的測(cè)定

對(duì)于脫空區(qū)，由于其中充滿潮濕的空氣，含水率不可知，其波速也不可測(cè)，因而無法準(zhǔn)確的確定脫空高度，只能給出一個(gè)概值。

將摘眼球后所取血液置試管中4℃, 3 000 r/min離心30 min，吸取上清，置-20℃冰箱中，備用。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法，分別測(cè)定小鼠血清中IL-6、LTB4和ICAM-1含量。檢測(cè)程序按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 肺臟形態(tài)學(xué)觀察

將固定后的肺組織樣本行石蠟包埋切片，切片5 μm，經(jīng)HE染色、中性樹膠封固后顯微鏡觀察照相。

1.9 免疫組化分析

肺組織常規(guī)包埋切片后，脫蠟、透明。采用一步法，一抗?jié)舛葹? mg/m l，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照片(用抗體稀釋液體PBS替代一抗)，DAB顏色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封片。陽性結(jié)果為細(xì)胞膜(AQP5)上顯棕黃色顆粒沉淀; 陰性對(duì)照片顯示細(xì)胞核及細(xì)胞膜呈藍(lán)色, 胞質(zhì)及整片組織呈淡藍(lán)色背景。采用HM IAS-2000軟件分析, 計(jì)算圖像光密度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所得結(jié)果以x-± s表示。取P＜0.05作為顯著性差異水平。

2 結(jié)果

2.1 流感病毒半數(shù)致死量

采用W u等[7]的方法，計(jì)算其LD50為10-3.60，實(shí)驗(yàn)用10LD50流感病毒量，以確保病毒模型組死亡率處于60%～90%。

2.2 肺指數(shù)及W/D比值觀察

表1結(jié)果表明, 模型對(duì)照組肺指數(shù)及肺W/D值均顯著升高，與正常對(duì)照組比較，具有顯著性差異(P＜0.01)，表明流感病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞嚴(yán)重受損，造成肺氣血屏障損傷和肺水腫。NHDC高、中、低各劑量給藥組均可明顯降低感染小鼠的肺指數(shù)和肺W/D值，提高肺指數(shù)抑制率，減輕小鼠流感病毒所致肺炎的病變程度，呈一定的量效關(guān)系，表明NHDC能明顯減輕流感病毒導(dǎo)致的毛細(xì)血管通透性增加和肺間質(zhì)性水腫。

2.3 血清炎性介質(zhì)檢測(cè)

由表2結(jié)果可知，病毒模型對(duì)照組小鼠血清中

表1 流感感染誘導(dǎo)小鼠肺損傷及NHDC的保護(hù)作用

表2 流感感染小鼠血清炎性介質(zhì)含量及NHDC的抑制作用

IL-6、LTB4和ICAM-1含量明顯升高，與正常對(duì)照組相比較，具有顯著性差異(P＜0.01)，表明流感病毒可誘導(dǎo)感染小鼠機(jī)體炎性介質(zhì)的大量釋放，促進(jìn)肺氣血屏障損傷; 而經(jīng)NHDC給藥治療后血清中IL-6、LTB4和ICAM-1含量均明顯降低，與模型對(duì)照組相比較，均具有極顯著性差異(P＜0.01或P＜0.05)，且呈一定的量效關(guān)系，表明NHDC可抑制流感病毒感染引起的炎癥反應(yīng)的作用。

2.4 肺組織病理學(xué)觀察

圖2 流感感染小鼠肺組織AQP5蛋白表達(dá)水平

光鏡下觀察各組小鼠肺臟病理組織學(xué)變化如圖1，正常對(duì)照組肺泡大小較一致，肺泡壁菲薄，支氣管上皮完整，管腔內(nèi)無分泌物，其外周未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型對(duì)照組則呈重度間質(zhì)性肺炎病變，可見支氣管上皮脫落，肺泡間隔增厚，充血，肺泡壁和細(xì)支氣管壁周圍大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，形成實(shí)變區(qū)，肺泡腔內(nèi)大量漿液性慘出。與模型對(duì)照組相比, NHDC高、中、低劑量給藥組肺損傷病變程度均較模型對(duì)照組明顯減輕，肺泡和血管內(nèi)中性粒細(xì)胞聚集不明顯, 肺組織間隙中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，紅細(xì)胞滲出不明顯。

2.5 AQP5免疫組化分析

AQP5陽性物質(zhì)呈棕黃色、顆粒狀，主要在肺泡上皮細(xì)胞的肺泡腔面，氣道分泌上皮頂質(zhì)膜上也有分布。由圖2和圖3結(jié)果可知，在正常對(duì)照組小鼠肺組織中AQP5蛋白表達(dá)較多，表現(xiàn)為細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)彌漫性黃色或棕黃色顆粒，而病毒模型組小鼠肺細(xì)胞核中AQP5蛋白表達(dá)則明顯減少。與模型對(duì)照組相比較，NHDC各劑量給藥組AQP5表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加(P＜0.01)，表明NHDC可上調(diào)流感病毒引起的肺組織AQP5表達(dá)減少。

3 討論

圖1 流感感染小鼠肺組織HE染色病理觀察(×200)

圖3 流感感染小鼠肺組織AQP5蛋白免疫組化結(jié)果

流感病毒屬呼吸道病毒。在病毒性肺炎發(fā)生過程中，機(jī)體會(huì)出現(xiàn)炎癥介質(zhì)失衡，同時(shí)產(chǎn)生大量的氧自由基，引起脂質(zhì)過氧化，直接導(dǎo)致急性肺損傷(ALI)損傷。其中，氣血屏障的破壞是流感病毒造成肺損傷主要的病理基礎(chǔ)[10,11]，其以肺泡毛細(xì)血管膜損傷為基礎(chǔ)，滲透性肺水腫和炎癥反應(yīng)為特征。流感病毒可導(dǎo)致感染小鼠肺組織炎癥的形成，致使肺泡間隔增厚、充血、肺泡腔內(nèi)大量漿液性慘出、肺組織重量增加，同時(shí)流感病毒感染小鼠的體重往往降低或不增加。因此，從宏觀上，肺指數(shù)值的大小可以反映肺部病變炎癥反應(yīng)的嚴(yán)重程度。而肺W/D比值可作為衡量肺組織毛細(xì)血管通透性增加、間質(zhì)和肺泡水腫的指標(biāo)。IL-6是流感病毒誘導(dǎo)的特異性炎性細(xì)胞因子，其與LBT4作為為重要的炎性趨化因子，可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)ICAM-1、VCAM-1等，促使中性粒細(xì)胞表達(dá)CD11b/CD18、CD11c/CD18等，從而增加白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用，促進(jìn)炎性細(xì)胞移動(dòng)到炎癥灶，引起以單核細(xì)胞浸潤(rùn)為主的間質(zhì)性肺炎。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，流感病毒感染后，模型對(duì)照組小鼠肺指數(shù)及肺W/D值顯著升高，病理組織觀察也發(fā)現(xiàn)模型對(duì)照組呈重度間質(zhì)性肺炎病變，可見支氣管上皮脫落，肺泡間隔增厚，充血，肺泡壁和細(xì)支氣管壁周圍大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)，形成實(shí)變區(qū)，肺泡腔內(nèi)大量漿液性慘出，證明流感病毒誘導(dǎo)的小鼠氣血屏障損傷模型建立成功。經(jīng)NHDC給藥治療后，小鼠肺組織炎癥病理狀態(tài)明顯改善，肺指數(shù)和肺W/D值明顯下降，與病毒模型組比較具有顯著性差異(P＞0.01)。

AQPs是一類對(duì)水有特異通透性的細(xì)胞膜蛋白，對(duì)機(jī)體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡有重要的生理和病理意義。其中，AQP5在肺泡上皮細(xì)胞上大量表達(dá)，是肺臟通調(diào)水轉(zhuǎn)運(yùn)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)[2]。肺組織AQP5表達(dá)或功能的下降，可導(dǎo)致機(jī)體清除過多水液的能力下降，加重肺泡及肺間質(zhì)性水腫。因此，AQP5的差異性表達(dá)是反映肺損傷肺內(nèi)氣血屏障功能改變的一個(gè)重要指標(biāo)[12]。本實(shí)驗(yàn)免疫組化結(jié)果顯示，流感病毒感染小鼠肺組織AQP5蛋白表達(dá)明顯下降，并與機(jī)體炎癥病理狀態(tài)的變化趨勢(shì)相一致；同時(shí)AQP5蛋白表達(dá)的下降不局限于肺部感染部位，而可見于全肺，證明AQP5與機(jī)體感染時(shí)肺部水液的異常轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。而經(jīng)NHDC給藥干預(yù)后，感染小鼠肺組織中AQP5蛋白表達(dá)顯著升高，且水腫情況和炎性介質(zhì)含量相對(duì)較輕，提示NHDC可通過調(diào)節(jié)AQP5蛋白的表達(dá)量對(duì)流感病毒引起的AQP5表達(dá)量減少, 從而抑制或緩解了流感病毒所致肺水腫的發(fā)展, 起到了對(duì)肺組織的保護(hù)作用，這可能是NHDC治療流感病毒所致氣血屏障損傷的藥效靶點(diǎn)。但進(jìn)一步的藥效機(jī)制尚需深入研究。

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Protective Effect of Neosperidin dihydrochalcone on Influenza Virus-induced Air-blood Barrier Injury in Mice

MAO Dong-sen1,2, CHEN Qin3, YU Chen-huan2, HU Yi-xiang2, ZHANG Cai-qiao1
(1. College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China; 2. Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China; 3. Department of Clinical Laboratory Medicine, Second affiliated hospital, Zhejiang university college of medicine, Hangzhou 310009, China)

ObjectiveTo explore protective effects of neosperidin dihydrochalcone (NHDC) on air-blood barrier injury in influenza virus infected mouse model.MethodsThe pneumonia model was established by infection of influenza virus. Model mice were treated w ith NHDC at different dose by gavage. The pulmonary index, wet/dry mass (W/D) ratio and the pathological changes of lung tissue stained w ith HE were investigated. The levels of serum IL-6, LTB4and ICAM-1 were determined by ELISA, while expression of aquaporin 5 (AQP5) was detected by immunohistochemistry.ResultsAfter challenge, the infected mice had obvious increase in pulmonary index and W/D ratio, which manifested by accum lation of significant numbers of neutrophils, accompanied by marked pulmonary edema and high levels of serum IL-6, LTB4and ICAM-1. The expression of AQP5 was also significantly increased in the lung of infected mice. However, oral administration of NHDC significantly reversed those adverse factors.ConclusionInfluenza virus could cause air-blood barrier damage in the lung of infected mice, and it may be related to the expression of AQP5. NHDC shows obvious effect to the injury.

Neosperidin dihydrochalcone(NHDC); Influenza Virus; Air-blood Barrier Injury; Aquaporin 5(AQP5)

Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0012-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.003

2013-07-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81202977), 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LQ12H28007, LY13H280002), 浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金

毛棟森(1983-), 男, 助理實(shí)驗(yàn)師, 研究方向: 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究, E-mail: maodongsen8396@163.com

張才喬(1965-), 男, 教授, 博士生導(dǎo)師, 研究方向:基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué), E-mail: cqzhang@zju.edu.cn