王麗娜，曾建明，王華成，李 沫，龍一飛，鄧光遠(yuǎn)，陳 茶

（1.廣東省中醫(yī)院大學(xué)城醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510006；2.廣州市腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510370）

慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）是造血干細(xì)胞水平發(fā)生的獲得性惡性血液腫瘤。染色體異位t（9；22）（q34；q11）形成BCR／ABL融合基因，其編碼的特異性融合蛋白BCR／ABL具有強(qiáng)烈酪氨酸激酶活性，異常調(diào)控多種生物學(xué)行為，引發(fā)宿主細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。BCR／ABL調(diào)節(jié)的主要信號通路有 NF-κB、STATs、PI3K、RAS-MAPK 等。NF-κB二聚體對靶啟動子的結(jié)合啟動了多種免疫調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄激活。

通過抑制BCR／ABL融合蛋白的活性，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)其下游信號通路來治療CML已有數(shù)年的歷史，其中最有代表性的BCR／ABL抑制劑就是格列衛(wèi)。格列衛(wèi)是特異性的BCR／ABL酪氨酸激酶抑制劑。用格列衛(wèi)抑制CML細(xì)胞的BCR／ABL活性會抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性［1］，受 NF-κB調(diào)控的基因表達(dá)也將受到抑制［2］。

Starczynowski等［3］研究了急性白血病細(xì)胞系HL-60細(xì)胞中microRNA（miR）-146a的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)HL-60細(xì)胞在用5-aza處理后，miR-145及miR-146a的水平呈3倍以上的升高。但對于CML細(xì)胞中miR-146a表達(dá)情況的研究尚未見報道。

本研究目的是觀察格列衛(wèi)作用后，NF-κB的下游靶基因miR-146a的表達(dá)情況，檢測能夠抑制甲基化酶表達(dá)的miR-29b水平的變化，并且檢測3種甲基化酶基因的表達(dá)水平，為分析miR-146a的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司，臺盼藍(lán)、MTT試劑分別為BBI公司及上海生工產(chǎn)品。格列衛(wèi)（100mg相對分子質(zhì)量589.7）為瑞士諾華公司產(chǎn)品。Trizol試劑購于東盛生物公司，Bio-Rad Ssofast EvaGreen PCR kit購于美國Bio-Rad公司，F(xiàn)ermentas逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購于法國Fermentas公司，U6、miR-146a、miR-29b逆轉(zhuǎn)錄及正、反向引物為廣州銳博公司產(chǎn)品，DNMTs引物由Invitrogen公司合成，GoldView核酸染料為賽百勝公司產(chǎn)品。所用的3種甲基化酶（DNMTs）引物序列如下，DNMT1上游：5′-GAG GAA GCT GCT AAG GAC TAG TTC-3′，下游：5′-ACT CCA CAA TTT GAT CAC TAA ATC-3′，產(chǎn)物大小：190bp；DNMT3a上游：5′-CAG CTT CCA CGT TGC CTT CT-3′，下游：5′-CAT CTG CAA GCT GTC TCC CTT T-3′，產(chǎn)物大小：66bp；DNMT3b上游：5′-TAC ACA GAC GTG TCC AAC ATG GGC-3′，下游：5′-GGA TGC CTT CAG GAA TCA CAC CTC-3′，產(chǎn)物大小200bp。

1.2 K562細(xì)胞培養(yǎng)及格列衛(wèi)IC50確定

1.2.1 K562細(xì)胞培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清（使用前于56℃恒溫水浴箱中放置30min以滅活補(bǔ)體）的RPMI1640培養(yǎng)基，細(xì)胞置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，適時換液及傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 格列衛(wèi)配置 母液 A，濃度為10mmol／mL；母液B，濃度為3.33μmol／mL；母液C，濃度為500μmol／L。

1.2.3 4%的臺盼藍(lán)母液配置 1g臺盼藍(lán)，加入少量蒸餾水研磨，加0.9%NaCl至25mL，用濾紙過濾，4℃保存。染色時，將2μL染液及18μL細(xì)胞懸液混合，充入計數(shù)池，立即于顯微鏡下計數(shù)，計算細(xì)胞抑制率（%）＝死細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4 配置5mg／mL MTT試劑 使用時于180μL細(xì)胞培養(yǎng)體系中加入上述 MTT溶液20μL（即 MTT終濃度為1mg／mL）。按每孔1 000個細(xì)胞接種至96孔板（總體積為180μL）置于37℃、5%CO2，飽和濕度條件下培養(yǎng)24h后，加入不同濃度的格列衛(wèi)，每一濃度設(shè)3個平行孔，陰性對照加入等量的磷酸鹽緩沖液（PBS）。繼續(xù)培養(yǎng)48h后每孔加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)板進(jìn)行離心，吸棄上清液，每孔中加入150μL DMSO，在492nm（檢測波長）／630nm（參比波長）處進(jìn)行檢測。以不加藥物的對照孔吸光度OD值在0.8～1.2為佳。

1.3 熒光定量PCR檢測mRNA

1.3.1 總RNA提取 分別取格列衛(wèi)處理的K562細(xì)胞、及生理鹽水處理（陰性對照）的K562細(xì)胞各1×106個。用PBS洗滌一次，置于1.5mL EP管中，加入1mL Trizol試劑，充分混勻。加入0.2mL氯仿，蓋緊后劇烈振蕩15s，室溫靜置5min，4℃12 000×g離心15min。取上層水相置于一新EP管中，加入0.5mL異丙醇，輕輕顛倒，充分混合均勻后，室溫靜置10 min。4℃12 000×g離心10min。棄上清液，加入1mL 75%乙醇，漩渦混勻，4℃7 500×g離心5min。棄上清液，室溫干燥10min，加20μL焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解。在Nanodrop核酸定量分析儀上測定RNA濃度。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄 miRNAs的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟如下：首先加入RT-PCR反應(yīng)體系的試劑并進(jìn)行變性退火：RT-PCR引物（62.5nM）2μL，RNA 2μL，加ddH2O至19μL。放入PCR儀70℃10min進(jìn)行變性退火反應(yīng)。之后繼續(xù)加入反應(yīng)體系：5×緩沖液（Buffer）10μL，2.5nM dNTP 2μL，Prime Script RTase 200U／μL 2.5μL，加ddH2O 至50μL，按30 ℃ 10 min，42℃60min，70℃15min的反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

1.3.3 熒光定量PCR 依照說明書操作ABI 7500Real-Time PCR System，反應(yīng)體系如下：Sso Fast EvaGreen supermix with low Rox 9μL，正向引物2μL，反向引物2μL，RT-PCR反應(yīng)液2μL，無RNA酶的ddH2O 5μL。擴(kuò)增過程如下：95℃預(yù)變性20s；95℃10s，60℃34s；擴(kuò)增40個循環(huán)后進(jìn)行熔解曲線分析。數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析，以陰性對照為參照進(jìn)行計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各指標(biāo)的結(jié)果采用±Sx表示，組間比較用方差分析，當(dāng)方差齊時組間兩兩比較用LSD，當(dāng)方差不齊時，組間兩兩比較用Dunnett′s T3，格列衛(wèi)IC50的確定，采用MTT法，并參考文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 格列衛(wèi)最適濃度的選擇 由于本實(shí)驗(yàn)采用的是未經(jīng)純化處理的格列衛(wèi)，因此需要重新確定其作用于K562的IC50濃度。臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示，生理鹽水以及系列濃度（10、20、30、40、50μmol／L）的格列衛(wèi)作用于K562細(xì)胞，細(xì)胞抑制率結(jié)果如圖1所示。MTT實(shí)驗(yàn)確定IC50濃度為40.85μmol／L，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中格列衛(wèi)的濃度選用30、50μmol／L兩種濃度。

圖1 不同濃度格列衛(wèi)作用于K562細(xì)胞的細(xì)胞存活率（±Sx）

2.2 miR-146a、miR-29b表達(dá)水平改變 miR-146a水平在格列衛(wèi)作用后顯著升高（P＜0.05），miR-29b水平在格列衛(wèi)作用后上升，結(jié)果見表1。

表1 格列衛(wèi)作用后K562細(xì)胞中miR-146a及miR-29b表達(dá)水平改變

表2 格列衛(wèi)作用后K562細(xì)胞中甲基化酶的表達(dá)水平改變

2.3 格列衛(wèi)作用后K562細(xì)胞甲基化酶表達(dá)水平改變 30、50μmol／L格列衛(wèi)作用后，K562細(xì)胞中甲基化酶基因mRNA的變化呈下降趨勢，見表2。

3 討 論

MiR-146a在造血及免疫反應(yīng)中具有重要作用［5-7］。格列衛(wèi)是特異性的BCR／ABL酪氨酸激酶抑制劑。格列衛(wèi)抑制K562細(xì)胞中BCR／ABL活性后，導(dǎo)致系列生物學(xué)行為的改變，其中包括 NF-κB、cMyc的抑制等［8］。作為 NF-κB的下游靶基因之一，miR-146a的表達(dá)在STI571作用后卻并未受到抑制。本研究在臨床患者（結(jié)果未顯示）及體外細(xì)胞研究中均發(fā)現(xiàn)，格列衛(wèi)作用后，患者外周血單個核細(xì)胞中miR-146a水平無顯著變化，格列衛(wèi)作用于K562細(xì)胞，可使其細(xì)胞內(nèi)miR-146a水平升高，與Stéphane Flamant等［9］的研究結(jié)果相互印證。但本研究選取的病例均為慢粒加速期的患者，而Stéphane Flamant等［9］的研究中納入為初診慢粒患者，并且均為首次接受IM治療。Wang等［10］的研究結(jié)果顯示 miR-146a的表達(dá)水平與ALL和AML患者的生存呈相反的關(guān)系，高表達(dá)miR-146a的患者臨床預(yù)后相對差。但Wang等［10］的研究對象為急性白血病，與CML不可比較，無論細(xì)胞遺傳學(xué)分型還是疾病的治療方面均有顯著差異。因此，本研究結(jié)果為全面理解miR-146a在CML中的調(diào)控及作用機(jī)制提供了新的證據(jù)和線索。

MiR-29b可以通過直接下調(diào)DNMT3A、DNMT3B，以及通過sp1間接下調(diào)DNMT1，從而導(dǎo)致大部分DNA的去甲基化，進(jìn)而使得急性白血病細(xì)胞中多種腫瘤抑制基因得以重新表達(dá)［11-12］。本研究結(jié)果也顯示了格列衛(wèi)作用后miR-29b的水平升高。

本研究結(jié)果表明，格列衛(wèi)作用后，三種甲基化酶的水平降低，結(jié)合Starczynowski等［3］對pre-miR-146a啟動子區(qū)進(jìn)行甲基化分析的結(jié)果，本研究認(rèn)為甲基化酶水平降低是格列衛(wèi)作用后miR-146a升高的原因之一，也就是說，K562細(xì)胞中甲基化酶水平升高導(dǎo)致miR-146a前體啟動子區(qū)的甲基化，這是K562細(xì)胞中miR-146a維持在較低水平的原因之一。

在今后的實(shí)驗(yàn)中將繼續(xù)探討升高miR-146a對K562細(xì)胞的作用，并進(jìn)一步從轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力等方面，探討格列衛(wèi)作用后miR-146a不降反升的可能作用機(jī)制。

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