朱淦芳

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江杭州 310053)

衰老是指機(jī)體逐漸失去對(duì)周圍環(huán)境的應(yīng)激能力,不能維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[1],導(dǎo)致功能下降及生理功能紊亂的綜合表現(xiàn)。衰老時(shí)機(jī)體抗氧化酶活性降低,抗氧化能力下降,自由基產(chǎn)生過多往往作用于不飽和脂肪酸,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)使生物大分子之間發(fā)生交聯(lián),致使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞而喪失功能[2]。實(shí)驗(yàn)證明運(yùn)動(dòng)能夠通過影響自由基的生成或清除來改變機(jī)體抗氧化能力,抵抗衰老(如:跑步[3]、游泳等有氧運(yùn)動(dòng)能改善自由基代謝),但運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的大小所產(chǎn)生的干預(yù)效果尚未明確。本研究首次通過建立D-半乳糖亞急性衰老模型,研究小鼠在不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)后,與自由基代謝密切相關(guān)的血清(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)和丙二醛(MDA)等指標(biāo)的變化,分析不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的抗衰老干預(yù)效果。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組及衰老模型的建立

昆明種小鼠50只(由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供,體重22～26g,雌雄各半。動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)SCXK(滬)2008-0016,動(dòng)物設(shè)施合格證號(hào)SYXK(浙)2008-0115,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)合格證號(hào)SYXK(浙)2008-0115)。異性分籠飼養(yǎng),室溫控制在(25±1)℃,相對(duì)濕度控制在55%左右,自然光照,自由飲水,飼料選用國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物混合飼料。50只小鼠隨機(jī)分為大、中、小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組,衰老模型對(duì)照組和正常對(duì)照組,每組各10只,雌雄各半。

研究表明D-半乳糖擬衰老模型在小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上都表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的病理生理改變過程,表現(xiàn)為生化指標(biāo)異常、免疫功能下降、組織細(xì)胞的損傷及細(xì)胞生長繁殖能力下降、細(xì)胞退行性變、認(rèn)知障礙等。本研究中,三個(gè)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組和衰老模型對(duì)照組鼠頸背部皮下注D-半乳糖溶液100mg·kg-1·d-1,正常對(duì)照組小鼠注射100mg·kg-1·d-1的生理鹽水。

三個(gè)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組每天進(jìn)行跑步干預(yù),記錄小鼠生理狀況、死亡個(gè)體等跑步情況,運(yùn)動(dòng)干預(yù)持續(xù)6周。大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組:第1～6周速度14m·min-1,每通道2只小鼠一起進(jìn)行,持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間為60min;中運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組:第1～6周速度12m·min-1,每通道2只小鼠一起進(jìn)行,持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間為45min;小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組:第1～6周速度10m·min-1,每通道2只小鼠一起進(jìn)行,持續(xù)運(yùn)動(dòng)時(shí)間為30min。

表1 不同干預(yù)后各組小鼠血清SOD、GSH-PX 活性及MDA 含量比較±s)

表1 不同干預(yù)后各組小鼠血清SOD、GSH-PX 活性及MDA 含量比較±s)

注:*與衰老模型組比較,P<0.05;#與正常對(duì)照組比較,P<0.05;^在實(shí)驗(yàn)過程中有2只小鼠死亡淘汰。

組別 SOD(U/mgprot) GSH-PX（U/mgprot） MDA（nmol/mgprot）χ±s χ±s χ±s大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組n=9^ 113.23±9.97 * 273.93±16.0314.67±3.83中運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組n=10126.78±12.59 *? 421.00±19.90 * 11.27±4.79 *小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度組n=1098.30±11.39398.68±14.8314.90±4.46衰老模型組n=9^ 83.66±9.68 # 360.29±15.66 # 17.13±2.57 #正常對(duì)照組n=10128.32±13.41434.95±20.5212.68±3.70

衰老模型對(duì)照組和正常對(duì)照組:不強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng),在籠中自由走動(dòng),持續(xù)6周。

1.2 主要試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)試劑:D-半乳糖(P302003,上海迪柏化學(xué)品技術(shù)有限公司)、氯化鈉(100601,上海試四赫維化工有限公司)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

實(shí)驗(yàn)儀器:可調(diào)速平面跑步機(jī)(805型大小鼠平面跑步機(jī),美國IITC公司)、酶標(biāo)儀(MK3,上海雷勃分析儀器公司)、冷凍高速離心機(jī)(Thermo Jouan CR3i,德國Thermo)、精密電子天平(PB602-A,梅特勒托利多上海公司)、電熱恒溫水浴箱(DKB-450,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)、旋渦混合器(XW-80A,上海精科實(shí)業(yè)有限公司)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DGG-9240A,上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.3 指標(biāo)測(cè)試方法

實(shí)驗(yàn)6周后,小鼠禁食18h,稱量小鼠體重后,摘小鼠眼球取全血于1.5mlEP管中,4℃,4000r·min-1離心10min,分離血清。根據(jù)試劑盒說明書,黃嘌呤氧化酶法測(cè)SOD的活性,二硫?qū)ο趸郊姿岱y(cè)GSH-PX的活性,硫代巴比妥酸法測(cè)MDA的含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

使用SPSS 17.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理,數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異意義。

2 結(jié)果

由表1可見,衰老模型組與正常對(duì)照組比較,小鼠血清SOD、GSH-PX活性均有顯著性降低(P<0.05),MDA含量有顯著性升高(P<0.05),表明D-半乳糖擬衰老模型成功建立。運(yùn)動(dòng)干預(yù)組與衰老模型組比較,大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組小鼠血清SOD活性有顯著性升高(P<0.05),GSH-PX活性和MDA含量則無顯著性差異;中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組血清SOD、GSH-PX活性均有顯著性升高(P<0.05),并且MDA含量有顯著性降低(P<0.05);小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組小鼠的血清SOD、GSH-PX活性和MDA含量則均無顯著性差異。與衰老模型組比較,結(jié)果表明中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)組血清SOD、GSH-PX活性和MDA含量的改善變化幅度均大于其它兩種運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度。

3 討論

3.1 本試驗(yàn)D-半乳糖致衰老模型的建立

研究表明D-半乳糖擬衰老模型在小鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的病理生理改變過程,如生化指標(biāo)異常、免疫功能下降、組織細(xì)胞損傷、細(xì)胞生長繁殖能力下降、細(xì)胞退行性變及認(rèn)知障礙等衰老表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)采用給小鼠連續(xù)6周皮下注射D-半乳糖100mg·kg-1·d-1,結(jié)果發(fā)現(xiàn)衰老模型組血清SOD、GSH-PX活性均顯著低于正常對(duì)照組,MDA含量顯著高于正常對(duì)照組,造成動(dòng)物糖代謝紊亂,說明本試驗(yàn)D-半乳糖致衰老模型成功建立。

3.2 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)與自由基代謝密切相關(guān)的血清SOD、GSH-PX活性及MDA 含量的干預(yù)效果

自由基是機(jī)體正常代謝的中產(chǎn)物,其反應(yīng)能力強(qiáng),使細(xì)胞中的物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng),過量的自由基會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)的氧化損傷以及DNA的損傷,導(dǎo)致機(jī)體衰老。自由基學(xué)說是大家公認(rèn)的衰老理論之一,許多實(shí)驗(yàn)表明運(yùn)動(dòng)可能通過影響自由基的生成或清除來抵抗衰老。SOD是存在機(jī)體中主要的抗氧化酶,它的主要功能是清除機(jī)體代謝所產(chǎn)生的自由基,能有效防止脂質(zhì)過氧化的發(fā)生,防止組織損傷,提高運(yùn)動(dòng)能力,起到延緩衰老的作用。GSH-PX是一種含硒的酶,在催化還原型谷胱甘肽(GSH)氧化成氧化型谷胱甘肽(GSSG)的反應(yīng)中消耗過氧化氫(H2O2)。SOD及GSHPX活性的高低間接反應(yīng)了機(jī)體清除氧自由基的能力。MDA是一種脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,能引起細(xì)胞代謝及功能障礙,因而引起細(xì)胞損傷,進(jìn)而加速機(jī)體衰老。因此,MDA是衡量機(jī)體自由基代謝的敏感指標(biāo),其含量能客觀地反映機(jī)體自由基產(chǎn)生和消除的情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)小鼠機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活性的干預(yù)效果不同。中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)對(duì)D-半乳糖致衰老小鼠血清SOD、GSH-PX的活性和MDA的含量均有顯著性改善,表明其抗氧化酶活性的作用明顯,可能具有直接或間接的降低機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度,增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力,保護(hù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能,從而達(dá)到改善機(jī)體自由基代謝紊亂及延緩機(jī)體衰老的效果。而大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)的小鼠SOD的活性雖增加,但GSH-PX活性的改善和MDA的含量降低不顯著,提示大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度抗衰老的干預(yù)效果尚不明確。小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)對(duì)衰老小鼠血清SOD、GSH-PX的活性和MDA的含量均無顯著性改善,表明其抗氧化的干預(yù)作用可能對(duì)小鼠機(jī)體刺激不夠,所以各相關(guān)指標(biāo)沒有發(fā)生顯著變化。可見,對(duì)于自由基代謝來說,不能認(rèn)為所有的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)都是適合的,不同的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度產(chǎn)生的干預(yù)效果可能是不同的。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明中等運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)衰老小鼠血清抗氧化物酶SOD和GSH-PX的活性及MDA含量的干預(yù)效果幅度大于其它運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù)(如大運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和小運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度干預(yù))。由此可見,適宜的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可能更有利于提高抗氧化物酶的活性,降低自由基的含量,并抑制MDA的形成,從而延緩衰老的退行性變化。

[1]葉牡丹,陳冀杭.運(yùn)動(dòng)對(duì)衰老機(jī)體抗氧化能力影響綜述[J].武漢體育學(xué)院學(xué)報(bào),2005,39(6):66-68.

[2]于亞威,徐廣濤,潘曉燕,等.杭白菊對(duì)衰老小鼠肝組織SOD、GSH-PX、MDA表達(dá)的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2011,41(1):53-55.

[3]尤春英,岑浩望,田亞平,等.不同負(fù)荷跑臺(tái)訓(xùn)練對(duì)大鼠腦自由基代謝及其防御系統(tǒng)酶活性的影響[J].中國運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志,2001,20(2):202-204.