劉 燕，楊建松，王 露，王德培

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

等離子誘變選育檸檬酸高產(chǎn)菌

劉 燕，楊建松，王 露，王德培

(工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457)

黑曲霉TN09是1株檸檬酸生產(chǎn)菌株．為了進(jìn)一步提高檸檬酸的生產(chǎn)水平，利用等離子對檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉TN09進(jìn)行了誘變．誘變后的孢子懸液涂布玉米液化液平板，35℃培養(yǎng)至72h測量透明圈直徑，以酸解透明圈直徑大于2.2cm、菌落直徑大于0.5cm、其比值大于4.8的菌落作為初篩檸檬酸菌株，然后進(jìn)行搖瓶復(fù)篩獲得了1株遺傳性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌，與出發(fā)菌株(產(chǎn)酸12.46g/dL)相比產(chǎn)酸增幅達(dá)到8.67%．

黑曲霉；檸檬酸；等離子誘變

檸檬酸是一種重要的有機(jī)酸，在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，也是世界上以液體深層發(fā)酵方法生產(chǎn)的產(chǎn)量最大的有機(jī)酸，2012年世界年產(chǎn)量約為180萬噸．我國是檸檬酸主要生產(chǎn)國，年產(chǎn)量為107萬噸，占世界總產(chǎn)量的61%左右[1–5]．

等離子體是大量相互作用的但仍處于非束縛狀態(tài)下的帶電粒子組成的宏觀體系，是與固態(tài)、液態(tài)、氣態(tài)處于同一層次上的物質(zhì)的第四態(tài)．等離子是電離氣體，這些物質(zhì)能與生物體內(nèi)的生物大分子(酶或DNA)相互作用，從而引起生物體的死亡或突變．等離子作為一種物理誘變手段，具有快速、低溫、操作簡便、無毒性以及誘變效果好等優(yōu)點(diǎn)，將等離子體應(yīng)用于微生物誘變育種還是一個嶄新的技術(shù)[6]．

考慮到檸檬酸生產(chǎn)菌種經(jīng)過幾十年的誘變已經(jīng)對傳統(tǒng)誘變產(chǎn)生一定的抗性，所以采用了新型誘變方法——等離子誘變，希望獲得產(chǎn)酸高、轉(zhuǎn)化率高、能耗低、生產(chǎn)成本低的檸檬酸生產(chǎn)菌株．本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果對提高檸檬酸的產(chǎn)量與質(zhì)量、增強(qiáng)我國檸檬酸國際市場競爭力、促進(jìn)檸檬酸行業(yè)的發(fā)展有著重要的參考價值．

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉(Aspergillus niger)TN09，本實(shí)驗(yàn)室保存．

1.2 原料及其預(yù)處理

馬鈴薯、玉米粉均由山東日照魯信金禾生化有限公司提供．

玉米液化液制備：玉米粉與水以1∶4的比例混合，攪拌均勻后加熱到70℃，加入耐高溫的α–淀粉酶(0.5kg/t)，保溫10min后加熱到90℃保溫4～5h，碘檢不變色，趁熱經(jīng)兩層紗布過濾．濾清液冷卻后加水調(diào)整總糖到要求的濃度[7–8]．

1.3 儀器設(shè)備

ARTP室溫等離子誘變系統(tǒng)(atmospheric and room temperature plasma，ARTP)，北京思清源生物科技有限公司；G6型迅數(shù)全自動菌落分析儀，杭州迅數(shù)科技有限公司；JNOECXS212201型顯微鏡，Olympus公司．

1.4 培養(yǎng)基

PDA斜面培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯的煮汁200，葡萄糖20，瓊脂粉20，121℃滅菌20min．

PDA平板培養(yǎng)基(g/L)：馬鈴薯的煮汁200，葡萄糖20，瓊脂粉15～20，121℃滅菌20min．

玉米液化液平板(g/L)：總糖為6%的玉米液化液，MgSO4·7H2O 1.5，K2HPO43.6，瓊脂粉20，121℃滅菌20min；

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：總糖為18%的玉米液化液121℃滅菌20min．

1.5 培養(yǎng)方法

斜面培養(yǎng)：35℃培養(yǎng)7,d．

搖瓶培養(yǎng)：500mL三角瓶中裝入50mL玉米液化液培養(yǎng)液，121℃滅菌20min，采用活菌計(jì)數(shù)法接入活孢子濃度為5×104mL–1，搖床轉(zhuǎn)速330r/min，35℃振蕩培養(yǎng)72h．

1.6 誘變方法

1.6.1 菌種活化

將黑曲霉TN09接入斜面培養(yǎng)基中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7,d，斜面培養(yǎng)基上長滿孢子．

1.6.2 樣品載片制備

將黑曲霉TN09的新鮮孢子制成孢子懸液后分散均勻，用生理鹽水調(diào)節(jié)孢子懸液濃度至105～106mL–1．取10μL孢子懸液，將其滴加在滅菌冷卻后的載玻片上．

1.6.3 等離子誘變過程

將載物臺上的載片放置區(qū)域紫外滅菌30min．將制得的樣品載片置于載臺上，使載片與射流出口的距離為2mm；打開工作氣體閥門，工作氣體即放電氣體為氦氣；打開外加電源，外加200V、13.56MHz的射頻電壓，此時射流溫度為室溫．樣品進(jìn)行輻照，輻照時間為80～180s．

1.7 篩選方法

1.7.1 初篩

將經(jīng)誘變后的孢子用無菌水洗下，涂布于玉米液化液培養(yǎng)基，培養(yǎng)72h后測量透明圈直徑．滿足酸解透明圈直徑大于2.2cm、菌落直徑大于0.5cm、其比值大于4.8的菌落作為初篩檸檬酸菌株，把這些菌落轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上進(jìn)一步篩選．

1.7.2 復(fù)篩

從初篩得到的斜面菌株上挑取適量的黑曲霉制備孢子懸液，接入活孢子濃度為5×104mL–1，接種于總糖為18%的玉米發(fā)酵液中．500mL三角瓶中裝入50mL培養(yǎng)液，35℃、300r/min振蕩培養(yǎng)72h，并稱量上搖瓶質(zhì)量m1、下?lián)u瓶質(zhì)量m2，每株菌設(shè)置3個平行度，產(chǎn)酸值取3個平行的平均值．

1.8 分析方法

1.8.1 菌落分析儀觀察

利用全自動菌落分析儀計(jì)算菌落直徑、透明圈直徑及其直徑比例．

1.8.2 活菌計(jì)數(shù)

從PDA斜面上挑取菌塊至50mL帶有玻璃珠的無菌水中，振蕩1h使孢子分散．準(zhǔn)確量取1mL菌液，稀釋104倍．準(zhǔn)確量取0.5mL稀釋菌液，涂布玉米液化液平板上，每個斜面涂布3個平行．將平板放置于生化培養(yǎng)箱，35℃培養(yǎng)24h，通過全自動菌落分析儀計(jì)數(shù)取平均值．

1.8.3 黑曲霉菌絲球形態(tài)的觀察

在發(fā)酵結(jié)束時，將發(fā)酵液置于顯微鏡下放大10倍觀察黑曲霉菌絲球的形態(tài)．

1.8.4 酸度測定

發(fā)酵液經(jīng)紗布過濾后取1mL置于250mL三角瓶中，用0.142,9mol/L NaOH滴定，0.5%酚酞指示劑2滴，以標(biāo)準(zhǔn)溶液滴至淡粉紅色，讀取消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積為V，則總酸含量按照式(1)計(jì)算，實(shí)際產(chǎn)酸(g/dL)按照式(2)計(jì)算．

式中：Y 為總酸含量，以一水檸檬酸計(jì)量(g/dL)；c為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量濃度(mol/L)；V為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗體積(mL)[9–10]．

1.8.5 致死率、突變率和誘變菌株產(chǎn)酸增幅的計(jì)算

致死率、正突變率、負(fù)突變率和誘變菌株產(chǎn)酸增幅分別按照式(3)—式(6)進(jìn)行計(jì)算．

式中：正突變的菌落數(shù)為透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑均大于出發(fā)菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑的菌落數(shù)；負(fù)突變的菌落數(shù)為透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑均小于出發(fā)菌落的透明圈直徑與菌落直徑比值、透明圈直徑的菌落數(shù)[10]．

2 結(jié)果與討論

2.1 玉米液化液平板篩選方法的確定

2.1.1 玉米液化液培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與透明圈大小的關(guān)系

在玉米液化液培養(yǎng)基的牛津杯孔洞內(nèi)各加50μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%、12%的檸檬酸溶液，8h后觀察，可以明顯看到由于檸檬酸擴(kuò)散所形成的酸解透明圈，如圖1所示．

圖1 在玉米液化液培養(yǎng)基中不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸形成的透明圈Fig. 1 Transparent circle of different concentrations of citric acid formed in the liquid medium of the liquefied corn

平板于35℃擴(kuò)散一定時間，測定形成透明圈的直徑，計(jì)算半徑平方，分別對玉米液化液培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與透明圈直徑、檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與透明圈半徑平方的關(guān)系作線性關(guān)系圖(圖2)，線性相關(guān)系數(shù)R2分別為0.902和0.929，均大于0.9，表明具有較好的線性關(guān)系．

圖2 玉米液化液培養(yǎng)基中檸檬酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)與透明圈直徑或半徑平方的線性關(guān)系Fig. 2Linear relationship between the citric acid concentration in the liquid medium of the liquefied corn and the diameter of the transparent circle or radius squared

由圖1和圖2可知，在玉米液化液培養(yǎng)基中，檸檬酸濃度與培養(yǎng)基中形成的酸解透明圈的直徑和半徑的平方均可形成較好的線性關(guān)系，而且酸解透明圈清晰可見，不需顯色劑即可準(zhǔn)確測量，因此玉米液化液培養(yǎng)基可用于產(chǎn)酸篩選．

2.1.2 黑曲霉TN09在玉米液化液培養(yǎng)基中的生長狀況

將黑曲霉TN09菌株制作孢子懸液，經(jīng)稀釋分別涂布于多個玉米液化液培養(yǎng)基上，每個平板控制菌落數(shù)在30個以內(nèi)，從24 h開始進(jìn)行觀察并記錄菌落直徑和透明圈直徑，記錄50個菌落，結(jié)果如圖3所示．

圖3 黑曲霉TN09在玉米液化液培養(yǎng)基中生長情況Fig. 3Growth of Aspergillus Niger TN09 in the liquid medium of the liquefied corn

從圖3可看出：隨著時間的增加，黑曲霉TN09菌落直徑和透明圈直徑不斷增加．在36 h時黑曲霉TN09產(chǎn)酸并形成透明圈，并隨時間增加其酸解透明圈直徑變大；在48 h時酸解透明圈直徑為0.8～0.85 cm，菌落直徑為0.2～0.3 cm，其比值為3.0～4.0；72 h時酸解透明圈直徑為2.0～2.2 cm，菌落直徑為0.45～0.5 cm，其比值為4.4～4.8，透明圈直徑與菌落直徑比值達(dá)到最大．因此，可在誘變后培養(yǎng)至72 h測量透明圈直徑，以酸解透明圈直徑大于2.2 cm、菌落直徑大于0.5 cm、其比值大于4.8的菌落作為初篩檸檬酸菌株．

2.2 誘變育種

2.2.1 等離子誘變時間的確定

誘變時間的選擇往往以致死率和正突變率為依據(jù)：若致死率太高，易產(chǎn)生負(fù)突變；若致死率太低，則突變較低．為了確定等離子的誘變時間，對80、100、120、140、160、180 s等離子誘變時間的孢子致死率進(jìn)行了測定，并通過玉米液化液平板透明圈方法計(jì)算正負(fù)突變率，結(jié)果如圖4所示．

圖4 黑曲霉TN09誘變致死率和正突變率Fig. 4 Curve of the mutagenized death rate and positive mutant rate of Aspergillus niger TN09

由圖4可以看出，以中性活性粒子作為作用粒子的等離子射流輻照待誘變微生物，黑曲霉孢子致死率隨著等離子誘變時間的延長而增加，但在160 s時，致死率有略微下降，誘變時間在140～160s正突變率較大，在160 s時正突變率達(dá)到最大，因此選取160 s為誘變時間．

2.2.2 搖瓶復(fù)篩產(chǎn)酸

通過玉米液化液平板初篩得到51株菌，將其進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)酸增幅較大的前10株菌產(chǎn)酸結(jié)果及其玉米液化液平板初篩所對應(yīng)的透明圈與菌落直徑比值見表1．

51株菌中，搖瓶產(chǎn)酸值大于出發(fā)菌株TN09的菌株共47株，占總數(shù)的92.16%，驗(yàn)證了玉米液化液平板篩選方法的可行性；產(chǎn)酸值大于對照的菌株誘變時間在140～160s的菌株共43株，占總數(shù)的84.31%，其中誘變時間為160 s的有31株．將產(chǎn)酸增幅大于5%的14株菌再次進(jìn)行搖瓶產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)，最終得到產(chǎn)酸增幅大于7%的兩株高產(chǎn)菌TN160s-D-3和TN120s-D-1，其產(chǎn)酸增幅分別為8.67%和7.22%．由于檸檬酸原始生產(chǎn)菌株是經(jīng)過多次誘變的菌株，對各種誘變手段已具有較高的耐受性，雖然等離子誘變是新型的物理誘變手段，但誘變后產(chǎn)酸增幅也不是過于明顯．

表1 突變株發(fā)酵產(chǎn)酸結(jié)果Tab. 1 Yield of citric acid through mutation

2.3 遺傳穩(wěn)定性

為了確保篩選到的高產(chǎn)菌的遺傳穩(wěn)定性，對TN160s-D-3和TN120s-D-1進(jìn)行了遺傳穩(wěn)定性考察，每代實(shí)驗(yàn)過程：高產(chǎn)菌株單菌落—斜面培養(yǎng)—搖瓶發(fā)酵測檸檬酸產(chǎn)量．將得到的兩株遺傳穩(wěn)定性較好的高產(chǎn)菌株TN160s-D-3和TN120s-D-1共傳10代，第2、4、6、8、10代搖瓶發(fā)酵，測定結(jié)果如圖5所示．

圖5 遺傳穩(wěn)定性Fig. 5 Genetic stability of the mutants

由圖5可知，突變得到的菌株TN160s-D-3遺傳穩(wěn)定性比較好．菌株TN160s-D-3在平板培養(yǎng)基上菌落緊湊，邊緣整齊，氣生菌絲短，孢子粗壯，顏色為黑褐色，無退化現(xiàn)象．顯微鏡觀察TN160s-D-3在玉米液化液搖瓶中菌球緊湊，為優(yōu)良的篩選菌．而TN120s-D-1產(chǎn)酸量則不斷下降，遺傳穩(wěn)定性很差，平板上的菌落形態(tài)逐漸發(fā)散，有恢復(fù)野生型的跡象．

3 結(jié) 論

采用等離子誘變方法對檸檬酸企業(yè)生產(chǎn)使用的出發(fā)菌株進(jìn)行誘變．在此過程中，建立玉米液化液平板初篩方法．該方法排除了以往加指示劑觀察透明圈對菌落生長的影響，獲得了1株比對照菌提高8.67%且遺傳性穩(wěn)定的高產(chǎn)酸菌株TN160s-D-3，并且確定了等離子最佳誘變時間為160 s．由此為進(jìn)一步的誘變育種工作提供了初篩方法和理論依據(jù)，這種誘變方法也可供其他微生物誘變育種時借鑒．

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責(zé)任編輯：郎婧

Breeding Aspergillus niger for Citric Acid through Plasma Mutation

LIU Yan，YANG Jiansong，WANG Lu，WANG Depei
(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

Aspergillus niger TN09,is a citric acid producing strain. In order to further improve the production of citric acid，citric acid production fungus Aspergillus niger TN09,was mutagenesised by plasma. The spore suspension after mutagenesis，which was cultured 72h at 35℃，was spread on the liquid medium of the liquefied corn. Then the diameter of the transparent circle was measured. It is considered as citric screening strains if the diameter of the transparent circle of the colony was greater than 2.2cm，the diameter of the colony was greater than 0.5cm，and the ratio was greater than 4.8,coloneis. A highyielding strain was obtained through shake flask rescreening. The new strain has genetic stability and the citric acid yield increased by 8.67% compared with that of the original strain(yield of citric acid 12.46g/dL).

Aspergillus niger；citric acid；plasma mutation；

TS201.3

A

1672-6510(2014)01-0016-04

10.13364/j.issn.1672-6510.2014.01.004

2013–07–11；

2013–10–21

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃“863計(jì)劃”資助項(xiàng)目(2011AA02A205)

劉 燕（1987—），女，河南人，碩士研究生；通信作者：王德培，教授，wangdp@tust.edu.cn.