王 蕊 劉春艷

(河北聯合大學 公共衛(wèi)生學院，河北 唐山 063000）

1 結核病現狀

作為一種傳染病，結核病主要分為慢性與緩發(fā)兩種，發(fā)病年齡多為15-35 歲，且治療效果欠佳，預后差。 該病在上世紀又被稱為癆病，并且有“十癆九死”的說法。 結核桿菌以呼吸道為媒介進行傳播，病變部位主要在肺部，此外腹膜、腦膜、淋巴尤其是頸部淋巴也是其主要繼發(fā)部位，結核病一般為慢性病程，以乏力、低熱為主要全身癥狀，以咯血、咳嗽為呼吸系統(tǒng)的特異性癥狀，影像學主要表現為結核結節(jié)繼發(fā)干酪樣壞死和空洞。 作為人類健康的主要威脅因素之一，結核病曾在歷史上大范圍的廣泛流行，世界衛(wèi)生組織調查顯示結核病新增患者每年約800 萬，死亡人數更是高達200 萬[1]，遠遠超過了其他多種傳染病如腹瀉、瘧疾及艾滋病的總死亡人數，隨著現代醫(yī)學進展尤其是臨床診斷和制藥水平的提高，自上世紀五十年代新一代抗結核藥物如異煙肼（INH）、利福平（RFP）不斷問世[2]，為有效治療結核病打下了堅實的基礎。但從上世紀80 年代開始，不合理用藥以及治療的不徹底而產生的耐多藥結核?。∕DR-TB）和廣泛耐藥結核病（XDR-TB），以及結核桿菌與艾滋病毒等病原體共感染等問題[3]，使得藥物的抗結核效果顯著降低，結核病發(fā)病率明顯上升，因此深入研究結核病，探索新的靶向藥物，既是一個醫(yī)學相關性科學難題，又是一個關系到全人類身體健康的重大社會問題，絕對不容忽視。

2 多羥基生物堿

多羥基生物堿（Polyhydroxylated alkaloids），作為一種天然非化合產物，其在動物、植物及微生物體中廣泛存在，是一種重要的糖苷酶抑制劑。多羥基生物堿可以轉化為糖苷酶配體的天然類似物并通過與相應活性位點特異性結合，發(fā)揮抑制效應，多羥基生物堿有三個別稱，分別為亞氨基環(huán)多醇（Iminocyclitol）、氮雜糖（Azasugars）、糖類生物堿（SugarShapedA1ka1oids）。 其在結構上與單糖類似，單糖環(huán)中的氧原子被氮原子替換后就可以形成多羥基生物堿，由于含氮雜環(huán)的種類繁多，羥基的數目以及立體化學也不同， 使得多羥基生物堿有著巨大的分子多樣性。 迄今為止，已經有超過100 個的多羥基生物堿被分離得到。

依據含氮雜環(huán)具體結構，多羥基生物堿共分為多羥基哌啶，多羥基吡咯烷，多羥基雙稠吡咯烷，多羥基去甲莨菪烷及多羥基吲哚里西啶生物堿五大類。

2.1 多羥基哌啶（Piperidine）生物堿

圖1 多羥基哌啶生物堿

Inouye 等（日本）最早于1996 年就成功獲得Nojirimycin 1，該物質來源于鏈霉菌，是一種鏈霉菌相關抗生素。 它是第一個純天然多羥基哌啶類生物堿，能夠介導葡萄糖苷酶活性的降低及最終失活[4]。 隨后Nojirimycin B 3（甘露糖型野尻霉素N）[5]及Galactostatin 5（半乳糖型野尻霉素）[6]也相繼從鏈霉菌中獲得，但相關C-1 位被羥基取代的化合物不是很穩(wěn)定，不便于分離和儲存。 但通過催化氫化或者硼氫化鈉等還原條件，可以把它們轉化成為1-脫氧衍生物，來提高其穩(wěn)定性。

在發(fā)現微生物中含有多羥基生物堿后不久，1974 年，人們從寥科植物蕎麥Fagopyrum esculentum 中分離出首個植物來源的多羥基哌啶生物堿Fagamine 8[7]。 隨后， 人們從桑樹的樹根中得到DNJ 2[8]-Moranoline。該物質被以后的研究證實也廣泛存在于細菌如鏈霉菌、桿菌中。 DNJ 可以充分抑制包括蔗糖酶、海藻糖酶、轉化酵素、麥芽糖酶及異麥芽糖酶在內的多種α-葡萄糖苷酶的活性， 而對葡萄糖苷酶I和II，β-葡萄糖苷酶，α-甘露糖苷酶，α-巖藻糖苷酶，α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶抑制活性較弱；DNJ 的C-2 差向異構體DMJ 4 （中文名：甘露糖型-1-脫氧野尻霉素）首先從豆科植物Lonchocarpus 中分離到，之后，人們發(fā)現它與DNJ 的C-1 位羥甲基取代物HNJ 6（中文名：高野尻霉素）共存于大戟屬植物Omphalea diandra 中[9]。 2005 年Crews從馬達加斯加島的海綿體獲得了Batzellasides 這一多羥基哌啶生物堿，該生物堿主要通過較長的烷基鏈取C-1 進行合成，這也是首次從海洋生物中分離到多羥基生物堿[10]。

2.2 多羥基吡咯烷（Pyrrolidine）生物堿

圖2 多羥基吡咯烷生物堿

通過對毛魚藤樹葉的分離，人們于1976 年發(fā)現了DMDP 10（全稱：2，5-Dihydroxyrnethyl-3，4-dihydroxypyrrolidine）[11]， 隨后又從不同種類的植物或微生物中提取得到[12]。 DMDP 在結構上與β-D-呋喃果糖相似，它對β-葡萄糖苷酶，α-葡萄糖苷酶，人β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶體β-甘露糖苷酶產生強效抑制。從被發(fā)現之日起，DMDP就作為多羥基生物堿領域的模型化合物，吸引了化學家和生物化學家們的廣泛關注和深入研究。 脫羥甲基DMDP 衍生物1，4-Dideoxy-1，4 -imino -D -arabinitol （D -ABI 9） 首 先 發(fā) 現 于 Angylocalyx boutiqueanus 的果實中[13]，后來也從別的植物中分離得到，對α-葡萄糖苷酶有較強抑制性， 它同DMDP 一樣也是熱帶和溫帶植物普遍存在的二級代謝物。

Nash 等通過分離野風信子Hyacinthoides non-scripta， 于 1997 年率先從其葉子中分離到 2，5-Dideoxy-2，5-imino-D-glycero-D-manno-heptitol （homoDMDP 11）[14]， 隨后人們又從風信子 Hyacinthus orientali 的球莖和綿棗兒Scilla campanulata 中分離得到。 HomoDMDP對多種糖苷酶（海藻糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶）均強效抑制。最新研究證實，6-C-butyl-DMDP 12 對淀粉葡萄糖苷酶及β-葡萄糖苷酶抑制性強，該物質主要由Adenophora triphylla var.japonica 風鈴分離得到，丁基取代DMDP 6 號碳原子最終合成，遺憾的是，到目前為止其C-6 位的相對構型仍未確定[15]。

2001 年，Kusano 等人[16]從半邊蓮植物 Lobelia chinensis Lour 中分離到含芳香環(huán)的多羥基吡咯烷Radicamine A 13 和Radicamine B 14，并發(fā)現它們對α-葡萄糖苷酶有很好的抑制性。 有趣的是，與其它全R型的多羥基吡咯烷不同，它們的絕對構型被定為全S 型。 而經過某些科學家研究證明，它的絕對構型和其它的多羥基吡咯烷一樣，均為全R 型[17]。

其實，上述多羥基生物堿其羥基被不同程度糖基化的產物也經常被分離到，例如通過對鏈霉素（Streptormyces sp.NK11687）分離，科研人員于1995 年成功獲得Gualamycin 15[18]。

2.3 多羥基吲哚里西啶（Indolizidine）生物堿

圖3 多羥基吲哚里西啶生物堿

隨后的1981 年， 人們從澳大利亞板栗樹Castanospermum australe的種子中提取出 Castanospermine 17（中文名：栗樹精胺），即 1，6，7，8-四羥基-吲哚里西啶生物堿[19]。他是一個雙環(huán)衍生物，來源于DNJ，其晶體的X-射線衍射數據表明其六員環(huán)的立體化學具有葡萄糖的構型[20]。從Castanospermum australe 中還分離得到6-epi-castanospermine 18[21]和7-deoxy-6-epicastanospermine 19， 前者分子中的哌啶環(huán)具有D-manno 的構型，它對人體內的中性α-甘露糖苷酶具有好的抑制活性，而后者對真菌的淀粉葡萄糖苷酶具有弱的抑制活性。另兩個多羥基吲哚里西啶生物堿2-epi-Lentiginosine 21 與Lentiginosine 20 能夠由紫云英Astragalus lentiginous 的葉子中分離得到， 前者對真菌的淀粉葡萄糖苷酶具有相當好的抑制活性，而后者對該酶則沒有抑制性[22]。

2.4 多羥基雙稠吡咯烷生物堿

圖4 多羥基雙稠吡咯烷生物堿

隨著Alexine 22 從豆科植物Alexa leiopetala 中被分離出來[23]，一類全新的C-3 位被碳原子取代的雙綢吡咯烷生物堿引起了人們的關注。 之后，人們從Castanospermum australe 的種子中分離到Australine 23[24]，其晶體的X-射線衍射數據表明它與Alexine 是互為C-7a 差向異構的一對一非對映異構體， 而且它可被看作是五員環(huán)的Castanospermine 或者構象固定的DMDP。Eugneia jambolana（桃金娘屬植物）及Casuarina equisetifolia（木麻黃屬植物）藥用價值極高，從前者的樹皮和后者的樹葉中，人們均分離到Casuarine 24[25]。 近年來通過分離風信子植物（Scilla campanulata、Hyacinthoids 和 non-scripta），成功得到雙稠吡咯烷 Hyacinthacine B1 26 和 Hyacinthacine C1 27，分別替換了 C-3、C-5 上的碳原子[26]。 具有長脂肪鏈的雙稠吡咯烷Broussonetine N 28 是由小構樹分離產生，它是第一個雙環(huán)形式存在的Broussonetines 家族多羥基生物堿[27]。

2.5 多羥基去甲莨菪烷（Nortropane）生物堿

隨著Calystegines 的成功分離， 多羥基去甲莨菪烷類生物堿開始作為一個新的種屬存在（圖17）[28]。 Calystegines 結構特點如下：1）具有N-去甲基莨菪烷的橋環(huán)結構骨架；2） 不同位置的橋環(huán)共同被多個輕羥取代，形成不同立體結構；3）羥基取代C-1 位（橋頭季碳）被羥基最終生成N，O-縮酮。

圖5 多羥基去甲莨菪烷生物堿

Calystegines 是人類第一個發(fā)現的植物相關性非直接代謝產物，其參與細菌及植物相關聯系的調節(jié)。 包括Convolvulus arrvernsis 及Calystegia sepium 在內的旋花科植物及包括Physalis alkengi 及Atropa belladonna 在內的茄科植物是Calystegines 的有效載體。 Calystegines還存在于一些可食用的水果和蔬菜（如馬鈴薯，茄子，番茄，酸漿果和桑葚） 中。 分類上， 現如今流行的分類方法主要是由于不同Calystegines 所含輕基數不同，進而分成的 A 類，B 類和 C 類。 而在這之前其主要分為A，B 兩類，分類依據為其在紙電泳中的遷移程度，同時根據HPLC 分離技術進行細化，A 類在此基礎上又分為A1，A2，A3等；同樣的方法也適用于Calystegine B。 如果Calystegine B 中氨基取代了1 號碳原子上的羥基那么就會形成不同的去甲莨菪烷（Calystegine N）， 此外還可以分離獲得Calystegines 相關的糖基化產物， 在Nicandra physalodes 果實中， 我們就可以發(fā)現葡萄搪糖基化Calystegine B1 3 號碳原子上的羥基后的相關產物[29]。

綜上所述，除了少數從微生物中分離外，大多數的多羥基生物堿都是從植物中分離出來的。 從物種演化的角度看，有些微生物或植物產生的多羥基生物堿釋放到土壤中而被其它植物吸收并在機體內累積。也有可能某些微生物如根瘤菌，它本身能產生多羥基生物堿，但是由于它與植物共生，后來人們從植物中提取出來，也就理所當然的當作是植物所產生的了。

3 多羥基生物堿與結核病

眾所周知，抗結核桿菌主要的作用靶點之一就是其細胞壁，只要能把結核桿菌的細胞壁破壞了，基本上就會消滅結核。 結核桿菌細胞壁主要有阿拉伯呋喃糖、半乳呋喃糖和甘露吡喃糖等物質組成的。 具有抗結核活性的多羥基生物堿類化合物乙胺丁醇（Ethambutol，EMB），其主要的抗結核原理就是能降低阿拉伯呋喃糖糖基轉移酶的活性來減少細胞壁中阿拉伯糖的合成的， 使結核桿菌的細胞壁變得十分脆弱，使結核桿菌的存活率降低。

圖6 阿拉伯呋喃轉換酶抑制劑

阿拉伯呋喃糖轉換酶拮抗劑37 和38 是Marotte 等人研制出的抗結核藥物[30]，這兩種藥物的結構十分類似，其外在骨架是由多羥基生物堿和阿拉伯呋喃糖苷組成， 多羥基生物堿上的N 被一個或數個阿拉伯呋喃糖烷基化。 藥理實驗證實：38 對阿拉伯呋喃糖結構酶的抑制作用要遠遠大于37，其機理尚不清楚。 之后，他們又生成了40、41，它們都是用亞甲基替代了呋喃環(huán)或糖苷上的O 來提高其穩(wěn)定性， 遺憾的是，體外實驗表明40 和41 與39 沒有明顯差別。

圖7 UDP-Glaf 轉換酶抑制劑

化學家Fleed 等人是最早開始研究抑制半乳呋喃糖相關酶活性藥物的， 并終于成功地在1997 年研制出首批降低半乳呋喃糖相關酶活性的多羥基生物堿類藥物[31]，代表藥物就是吡咯烷類多羥基生物堿42 及43， 后來又在深入研究的基礎上制成了多羥基生物堿44。 這3種藥物的生化結構大致相同，作用也是大致一樣，對結核桿菌的殺傷作用卻是42<43<44。

牛津大學的相關研究把重點放在了UDP-Glap 轉化為UDP-Glaf的過程中，認為只要把這一過程的UDP-Glaf 轉換酶加以抑制，就可以達到抑制半乳呋喃糖合成的目的，在這一原則下，在2004 年，Thomas小組合成了UDP-Glap 轉化為UDP-Glaf 的中間類似物45，45 可以起到競爭性抑制這一轉化過程的作用， 效果較好，45 又分為45a 和45b兩個亞型，這兩個亞型，雖然組成，結構等都大致相同，但是在抗結核桿菌上，效用大不一樣，且45b 幾乎沒有活性[32]。

2008 年，澳大利亞von Itzstein M 等科研人員以UDP-半乳糖轉換酶為靶點，合成了半乳呋喃糖烷基硫代糖苷，發(fā)現其具有較好的抗結核活性， 最低抑菌濃度 MIC 是 5mg/ml[33]。 同年， 法國的糖化學家Olivier R.Martin 教授報道了一系列UDP-半乳糖轉換酶抑制劑，以UDP-Galf 為底物，模仿其立體構型，設計一系列與其結構類似的目標化合物，經過多步合成反應完成其制備，藥理實驗尚在進行中[34]。

2009 年，Stéphane P.Vincent 課題組進一步發(fā)現了二磷酸尿苷-6-去氧-6-氟-D-半乳呋喃糖可競爭與UDP-半乳糖轉換酶結合干擾AG 的合成[35]，并證實結構中D-半乳呋喃糖6 位的附近是UDP-半乳糖轉換酶與底物相互作用的位點。

4 結束語

經過40 多年的發(fā)展， 多羥基生物堿作為小分子量的糖甘酶抑制劑，不僅在糖苷酶的機理研究方面作出了突出的貢獻，同時在結核病的治療方面也給人們帶來了福音。正越來越受到學術界以及商業(yè)界的廣泛關注。 深入展開其結構與活性之間的相關性研究具有重要意義。多羥基生物堿作為一種高效、低毒、無污染、對人畜安全的天然藥物必將受到人們的廣泛關注。 但由于其天然含量不高且難于分離純化，因此通過化學手段對其加以修飾或合成， 篩選高活性生物堿開發(fā)新藥等，都是未來對多羥基生物堿進行進一步研究的熱點內容。

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