康蕾，胡茂豐，劉素純,3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

不同單菌制曲豆醬風(fēng)味物質(zhì)及氨基酸分析比較

康蕾1，胡茂豐2，劉素純1,3*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙410128；3.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙410128）

分別采用米曲霉（Aspergillus oryzae）AS3.042、高大毛霉（Mucor mucedo）、根霉（Rhizopus）和黑曲霉（Aspergillus niger）制曲制醬，對后發(fā)酵黃豆醬中氨基酸態(tài)氮、風(fēng)味物質(zhì)和游離氨基酸進(jìn)行測定分析，發(fā)現(xiàn)在45 d氨基酸態(tài)氮含量最高，在45～65 d時氨基酸態(tài)氮含量保持穩(wěn)定；判定65 d為發(fā)酵終點(diǎn)。測得米曲霉65 d揮發(fā)性物質(zhì)是4種醬中最豐富的，測定米曲霉豆醬游離氨基酸含量為4種醬中最多，為174.17 mg/g干質(zhì)量，且種類最豐富。

黃豆醬；氨基酸組成；風(fēng)味物質(zhì)；固相微萃??；氣質(zhì)聯(lián)用

黃豆醬的生產(chǎn)始源于中國，它是我國人民的傳統(tǒng)調(diào)味品，因其特有的風(fēng)味、豐富的氨基酸含量深受廣大人民的喜愛。其香氣成分包括黃豆本身、霉菌代謝產(chǎn)物及非酶化學(xué)反應(yīng)生成物[1-2]，而人工制曲的黃豆醬香氣成分又與制曲菌種有一定的關(guān)系，不同菌種分解黃豆能力不同，產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)也不一樣。后發(fā)酵階段，在豆子中的酶以及微生物酶的作用下蛋白質(zhì)降解為小分子的肽和游離氨基酸，由于氨基酸和肽有各自的滋味，它們又與其他成分協(xié)同作用使得風(fēng)味物質(zhì)更加復(fù)雜。

李保英[3]通過采用不同菌種制曲制醬來研究醬油產(chǎn)生香味的機(jī)理，但此研究未對后發(fā)酵階段揮發(fā)性成分進(jìn)行分析比較。徐琳娜等[4]只對一種蠶豆醬在后發(fā)酵不同時間段的揮發(fā)性成分和氨基酸作了比較，未結(jié)合氨基酸測定進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)通過采用不同菌種制曲，同一后發(fā)酵條件制醬，通過氨基酸態(tài)氮含量變化結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析其揮發(fā)性成分變化，將游離氨基酸含量作為終產(chǎn)品評定標(biāo)準(zhǔn)，從而探討更充分利用黃豆?fàn)I養(yǎng)成分的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)貿(mào)市場；米曲霉（Aspergillus oryzae）、根霉（Rhizopus）、高大毛霉（Mucor mucedo）、黑曲霉（Aspergillus niger）：食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

實(shí)驗(yàn)所用主要化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L-8800日立型氨基酸自動分析儀、CR7日立Hitachi離心機(jī)：日本日立公司；7890A氣相色譜儀、5975C質(zhì)譜儀（GC-MS）：美國安捷倫公司；75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭：美國Supelco公司。

1.3方法

1.3.1 黃豆醬加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：大豆除雜，清洗3遍，除去不飽滿顆粒，浸泡10 h，瀝干，121℃蒸煮25 min，待豆子冷卻到40℃加入菌種，放入28℃培養(yǎng)48 h，再加入等量的10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的鹽水拌勻，放入陶瓷壇子中置于45℃培養(yǎng)箱進(jìn)行后熟。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮含量測定

用米曲霉、根霉、高大毛霉和黑曲霉分別制黃豆醬坯，用10%的鹽水拌勻，放入陶瓷壇子中置于45℃保溫腌制，每5 d取樣3次，用甲醛法[5]測定氨基酸態(tài)氮含量。

1.3.3 氣質(zhì)聯(lián)用分析不同發(fā)酵時期黃豆醬香氣成分

采用頂空固相微萃取不同菌種發(fā)酵不同時期的醬的香氣成分，再進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析香氣成分種類和含量。

頂空固相微萃取條件[4]：選用75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭，前先將萃取頭置于進(jìn)樣口處在250℃老化1 h，以除去污染，取3 g樣品加入氣質(zhì)專用瓶10 mL，在55℃條件下，保持15 min，再用萃取針萃取30 min，萃取完插入進(jìn)樣口，保留5 min。

色譜條件：毛細(xì)管柱為PEG20M，液膜厚度0.25 μm，孔徑為0.25 μm。

升溫條件：在50℃保持3 min，以10℃/min上升至150℃，再以8℃/min的速度上升到290℃，保持10 min。氣化室溫度：250℃，載氣為氦氣，流速1.0 mL/min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，燈絲發(fā)射流200 μA，離子源溫度250℃，接口溫度220℃，掃描范圍：45～500 m/z。

定性、定量方法：GC-MS測定出的總離子流色譜圖通過美國國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）08數(shù)據(jù)庫分析，計(jì)算出各香氣成分相對含量。

1.3.4 游離氨基酸分析

對不同菌種發(fā)酵腌制65 d進(jìn)行游離氨基酸測定[6]。

55℃條件下進(jìn)行樣品干燥，烘干至質(zhì)量恒定。取豆醬恒質(zhì)量干粉0.5 g，放入25 mL比色管，加8.3%三氯乙酸溶液至刻度，用封口膜封口，搖勻，室溫下超聲90 min，取上清液8 mL 4℃冷凍離心3 000 r/min，離心30 min，真空濃縮4 h，1 500 r/min。加入1 mL 0.01 mol/L HCl搖勻，6 000 r/min冷凍離心15 min。取上清液進(jìn)行上樣。

利用日立L8800全自動氨基酸分析儀，PF生理體液法，Li分離柱分離。樣品經(jīng)過分離柱利用四種流動相梯度洗脫后進(jìn)入反應(yīng)柱，135℃下與茚三酮及緩沖液反應(yīng)，最后進(jìn)入檢測器檢測吸光度值。分離柱利用PF-RG洗脫可再生。

色譜條件：緩沖液流速0.35 mL/min，茚三酮流速0.30 mL/min，通道1：檢測波長570 nm，通道2：檢測波長440 nm，進(jìn)樣量20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸態(tài)氮含量的動態(tài)變化

采用4種不同菌種發(fā)酵黃豆醬，比較產(chǎn)品氨基酸態(tài)氮含量的結(jié)果見圖1。由圖1可知，4種醬在0～45 d，氨基酸態(tài)氮含量總體呈現(xiàn)上升趨勢，其中米曲霉醬氨基酸態(tài)氮含量在整個時間段內(nèi)都比其他3種醬高。由此可見，米曲霉的蛋白酶水解作用較其他3種菌強(qiáng)，從而形成更多的氨基酸[7]。在45～65 d時，4種醬氨基酸態(tài)氮含量趨于穩(wěn)定，故選取第65天進(jìn)行揮發(fā)性成分的測定。

圖1 氨基酸態(tài)氮含量在發(fā)酵過程中的變化Fig.1 Change of amino acid nitrogen content during fermentation

2.2 豆醬香氣成分GC-MS分析

4種不同菌種后發(fā)酵65 d采用GC-MS分析豆醬揮發(fā)性成分，其總離子流色譜圖見圖2，其相對含量結(jié)果見表1。

圖2 豆醬65 d中揮發(fā)性組分GC-MS總離子流圖Fig.2 Chromatogram of soybean paste fermented 65 d by different strains

由表1可知，利用不同菌種制曲的黃豆醬其揮發(fā)性成分有差異，后發(fā)酵天數(shù)不同對揮發(fā)性成分也有影響[8]。

4種醬共檢測出49種物質(zhì)，其中醇類7種，醛類6種，酮類3種，酚類2種，酸類5種，烷烴類6種，酯類10種，其他物質(zhì)9種。

4種醬中醇類物質(zhì)最為豐富，所占百分比分別為30.96%、56.05%、41.44%、39.89%。4種醬都有2,3-丁二醇和1-辛烯-3醇。其中2,3-丁二醇是3-羥基-2-丁酮發(fā)生反應(yīng)生成。2-甲基丁醇，戊醇是醬風(fēng)味物質(zhì)的主要構(gòu)成[9]。

4種醬的醛類物質(zhì)所占百分比分別為24.58%、9.39%、21.16%、16.45%。4種豆醬中都檢測出的是異戊醛和苯乙醛。黃豆醬產(chǎn)生的刺激性氣味大多是醛類，而低分子質(zhì)量的醛類主要來自氨基酸降解和微生物轉(zhuǎn)化[10]，比如苯甲醛，苯乙醛是由苯丙氨酸降解得到[11-12]，由此可知，苯丙氨酸的含量發(fā)生下降。同時苯甲醛具有堅(jiān)果香氣。

4種醬酮類物質(zhì)所占百分比分別為8.12%、6.36%、7.06%、4.86%。在4種醬中均檢測出3-辛酮，4-羥基-3-甲基苯乙酮。3-羥基-2-丁酮并未檢測出，可能完全轉(zhuǎn)化成醇。

4種醬中均檢出愈創(chuàng)木酚和麥芽酚，所占百分比分別為4.24%、13.78%、53.88%、4.55%，酚類物質(zhì)對醬香有重大貢獻(xiàn)。

4種醬的酸類物質(zhì)所占百分比分別為6.01%、11.55%、10.48%、18.47%。4種醬都有正戊酸和2-甲基丁酸，分別來源于亮氨酸和纈氨酸的降解[13]。

4種醬的烷烴類物質(zhì)所占百分比分別為9.99%、1.00%、2.00%、3.68%。

4種醬的酯類物質(zhì)所占百分比分別為5.83%、1.60%、13.98%、7.97%。檢出的多數(shù)以乙酯形式存在。酯類化合物是醬香氣成分的主體，使醬具有香甜濃郁的味道。醇和酸可以形成酯類，酵母也可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成酯類[14]。

2.3 黃豆醬中游離氨基酸含量分析

對4種不同單菌種制曲后發(fā)酵65 d黃豆醬的游離氨基酸測定結(jié)果分別見圖3和表2。

圖3 黃豆醬游離氨基酸色譜圖Fig.3 Chromatogram of free amino acids of soybean paste

由表2可知，總游離氨基酸含量由高到低依次為米曲霉＞根霉＞黑曲霉＞高大毛霉。米曲霉制曲的豆醬游離氨基酸含量為174.17 mg/g干質(zhì)量，高于其他3種，其氨基酸種類有32種，高大毛霉檢測出28種，根霉和黑曲霉檢測出30種。根據(jù)氨基酸的呈味特征[15-16]，蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、賴氨酸呈現(xiàn)甜味，谷氨酸和天門冬氨酸呈酸味，組氨酸、酪氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸本身具有微苦的物質(zhì)，天門冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸有具有鮮味[17-18]。由表2可知，呈苦味氨基酸的含量最高，其次是鮮味氨基酸，甜味氨基酸，酸味氨基酸。游離氨基酸中7種必需氨基酸含量最高是米曲霉，含量為72.38 mg/g，還含有含有嬰兒生長發(fā)育期間所必需的組氨酸3.72 mg/g。

3 結(jié)論

氨基酸態(tài)氮含量是黃豆醬國標(biāo)當(dāng)中的重要指標(biāo)，也是呈味物質(zhì)，與風(fēng)味的形成密切相關(guān)。試驗(yàn)根據(jù)4種醬后發(fā)酵氨基酸態(tài)氮含量變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)4種醬揮發(fā)性物質(zhì)具有相同變化趨勢，GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)醇類物質(zhì)，且酚類、醛類物質(zhì)含量上升，這一研究結(jié)果與趙建新[19]對于黃豆醬后發(fā)酵揮發(fā)性物質(zhì)的變化的研究相一致。醇類、酯類、酚類對香味的形成貢獻(xiàn)最大，對醬的感官品質(zhì)影響也很大。2,3-丁二醇和1-辛烯-3醇，異戊醛和苯乙醛，3-辛酮和4-羥基-3-甲基苯乙酮，正戊酸和2-甲基丁酸，愈創(chuàng)木酚和麥芽酚，棕櫚酸乙酯、亞油酸乙酯和油酸乙酯是4種醬中都能檢測出來的，可以作為豆醬的特征性風(fēng)味物質(zhì)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)米曲霉醬揮發(fā)性物質(zhì)種類最豐富，米曲霉的醇類、酯類、酚類比例相對協(xié)調(diào)，香氣更柔和。

游離氨基酸測定也發(fā)現(xiàn)米曲霉醬游離氨基酸含量最高，為174.17 mg/g，并且種類最為豐富，因此，更能滿足人體需要。黃豆醬產(chǎn)生的低分子質(zhì)量的醛類主要來自氨基酸降解和微生物轉(zhuǎn)化，苯甲醛，苯乙醛來自于苯丙氨酸的降解，4種醬都有的正戊酸和2-甲基丁酸分別來源于亮氨酸和纈氨酸的降解。4種醬中呈苦味氨基酸的含量最高，其次是鮮味氨基酸，甜味氨基酸，酸味氨基酸，這可能與黃豆本身所含的氨基酸有關(guān)，徐琳娜[20]的研究表明豆瓣醬游離氨基酸中4種味道的氨基酸比例相一致。高大毛霉制曲的醬中游離氨基酸含量最低為63.05mg/g，且種類比其他3種醬少。

試驗(yàn)證明分別用米曲霉，高大毛霉，根霉，黑曲霉制曲制醬時，米曲霉制曲醬的氨基酸態(tài)氮含量高達(dá)0.856 g/kg，結(jié)果表明其揮發(fā)性物質(zhì)種類多于其他3種醬，對香味有貢獻(xiàn)的物質(zhì)含量最多，在香味和營養(yǎng)價值方面最理想，高大毛霉最不理想。

結(jié)果表明，用米曲霉制得的黃豆醬比另外3種更能充分利用黃豆的成分，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更高，更加利于人體吸收，為今后進(jìn)一步研究米曲霉制曲制醬提供一定依據(jù)。

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Comparison of flavor compounds and amino acids of soybean paste fermented by different moulds

KANG Lei1,HU Maofeng2,LIU Suchun1,3*
(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 3.Hunan Key Laboratories of Food Science and Biotechnology,Changsha 410128,China)

Koji and soybean paste were made usingAspergillus oryzaeAS3.042,Mucor mucedo,RhizopusandAspergillus nigeras fermentation starter,respectively.The amino acid nitrogen,flavor compounds and free amino acids contents of the products were determined and analyzed.The highest content of amino nitrogen was in 45 d,and amino nitrogen remained stable from 45 d to 65 d.At the 65 d,the soybean paste fermented byA. oryzaehad the most abundant volatile components and amino acids,and the free amino acid content was the highest of 174.17 mg/g dry weight.

soybean paste;amino acid composition;flavor components;solid-phase micro-extraction;GC-MS

TS207.3

A

0254-5071（2014）11-0140-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.032

2014-09-26

湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012NK3072）

康蕾（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

*通訊作者：劉素純（1966-），女，教授，博士，研究方向?yàn)闋I養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。