魏銘，顧盼，李程潔，楊航宇，劉樹(shù)勛，張嘉月，顏志秀，張柏林，朱保慶

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

高效液相色譜法測(cè)定篤斯越桔制品中7種有機(jī)酸的含量

魏銘，顧盼，李程潔，楊航宇，劉樹(shù)勛，張嘉月，顏志秀，張柏林，朱保慶*

（北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083）

采用高效液相色譜方法測(cè)定6種篤斯越桔制品中的有機(jī)酸含量，色譜條件為色譜柱：Venusil ASB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相：96.9%超純水-3%甲醇-0.1%甲酸；流速：0.5 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μm。該方法能夠快速、準(zhǔn)確地分離篤斯越桔相關(guān)制品中所含的7種有機(jī)酸，包括草酸、奎寧酸、蘋(píng)果酸、莽草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸。檢測(cè)結(jié)果表明，篤斯越桔中的有機(jī)酸主要為奎寧酸，其次是檸檬酸和蘋(píng)果酸，乳酸和乙酸的含量較少。

篤斯越桔制品；有機(jī)酸；高效液相色譜法

藍(lán)莓屬于杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium）植物，其果實(shí)不僅營(yíng)養(yǎng)豐富，而且含有有機(jī)酸、氨基酸、花色苷等獨(dú)特的功能性成分[1-4]，具有防治心血管疾病、抗癌、抗衰老等多種功效[5-8]。有機(jī)酸是藍(lán)莓果實(shí)中重要的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味成分，它的種類和含量是衡量果實(shí)及相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)[9]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定藍(lán)莓及其相關(guān)制品中有機(jī)酸的組成對(duì)研究藍(lán)莓果實(shí)的風(fēng)味特征及加工特性具有重要意義。

篤斯越桔（Vaccinium uliginosumL.）是大小興安嶺地區(qū)特有的一種野生藍(lán)莓，有著很高的營(yíng)養(yǎng)和保健價(jià)值[10]。目前，藍(lán)莓及其制品中有機(jī)酸含量的相關(guān)報(bào)道多數(shù)集中在栽培種高叢藍(lán)莓和矮叢藍(lán)莓[11-14]，有關(guān)篤斯越桔中有機(jī)酸的含量檢測(cè)尚無(wú)研究報(bào)道。本研究采用高效液相色譜方法系統(tǒng)分析了以篤斯越桔為原料制備的汁、果醬及發(fā)酵果酒中有機(jī)酸的組成和含量，該研究為進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)篤斯越桔產(chǎn)品酸感形成的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也對(duì)篤斯越桔加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓果汁（鮮榨汁）、大興安嶺藍(lán)莓果醬：內(nèi)蒙古呼倫貝市鄂倫春自治旗原生態(tài)公司；大興安嶺2013年發(fā)酵酒的桶儲(chǔ)和瓶?jī)?chǔ)樣品、大興安嶺2014年發(fā)酵酒樣、小興安嶺2013發(fā)酵瓶?jī)?chǔ)酒樣：北京林業(yè)大學(xué)食品科學(xué)系中試產(chǎn)品。

L-蘋(píng)果酸、草酸、乳酸、乙酸、檸檬酸：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；奎寧酸、莽草酸：成都曼思特生物科技有限公司。以上試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20 AT型高效液相色譜儀（配SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器）：日本島津公司；Venusil ASB C18色譜柱：天津博納艾杰爾科技有限公司；Milli-Q Academic超純水器：百壹星辰（北京）生物科技有限公司；FA（N）/JA（N）系列電子分析天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；TGL-16G臺(tái)式高速離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用超純水將各有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品配成單標(biāo)，分別進(jìn)樣，確定各自的出峰時(shí)間和先后順序，然后配制9種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，各組分的質(zhì)量濃度見(jiàn)表1。使用時(shí)將混合溶液用超純水依次稀釋2.0倍、2.5倍、3.3倍、5.0倍、10.0倍，得到不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，進(jìn)樣20 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，各組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表17 種有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的組成Table 1 Mixed standard solution of seven compounds

1.3.2 樣品前處理方法

進(jìn)樣前取1mL樣品，10000r/min離心10min，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取上清液稀釋一定倍數(shù)后進(jìn)行高效液相檢測(cè)。

1.3.3 定性與定量

在相同的色譜條件下，將樣品色譜圖與有機(jī)酸混標(biāo)的色譜圖進(jìn)行對(duì)照，根據(jù)保留時(shí)間確定樣品中各有機(jī)酸組分的色譜峰，結(jié)合有機(jī)酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)樣品中的有機(jī)酸進(jìn)行定量。

1.3.4 色譜條件

色譜柱Venusil ASB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：96.9%超純水-3.0%甲醇-0.1%甲酸；流速：0.5 mL/min；柱溫：室溫；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

在1.3.4的色譜條件下，對(duì)7種有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，得到混標(biāo)的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution

由圖1可知，各物質(zhì)分離度較好，出峰順序和出峰時(shí)間為草酸（6.406 min）、奎寧（7.173 min）、蘋(píng)果酸（8.575 min）、莽草酸（9.154 min）、乳酸（9.595 min）、乙酸（10.313 min）、檸檬酸（13.690 min），所有樣品在20 min內(nèi)出峰完畢。

依次測(cè)定梯度稀釋的有機(jī)酸混標(biāo)，以各有機(jī)酸質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，并計(jì)算相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。

表27 種有機(jī)酸的回歸方程和線性范圍Table 2 Regression equations and linear range of seven organic acids

由表2可知，各組分在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R為0.998 7～0.999 9，表明線性關(guān)系良好，檢測(cè)限為2.50～241.80 mg/L，能滿足定量分析的要求。

2.2 6種藍(lán)莓制品中有機(jī)酸含量的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)6種篤斯越桔制品中的有機(jī)酸進(jìn)行定量分析，高效液相色譜圖分別見(jiàn)圖2及圖3，有機(jī)酸含量分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，篤斯越桔制品中的有機(jī)酸以奎寧酸為主，其次是蘋(píng)果酸和檸檬酸，草酸、莽草酸的含量很低，乳酸和乙酸則幾乎沒(méi)有檢出。魏鑫等[15]的研究主要分析了4種常見(jiàn)栽培藍(lán)莓果實(shí)斯巴坦（Spartan）、伯克利（Berkeley）、澤西（Jersey）和北陸（Northland）中所含的有機(jī)酸主要是檸檬酸和蘋(píng)果酸；PHILLIPS M M等[13]從北高叢藍(lán)莓（Vaccinium corymbosum）SRM3287果實(shí)中檢測(cè)到奎寧酸（2.696±0.095）mg/g，但含量要低于檸檬酸（3.19±0.14）mg/g。

圖2 大興安嶺藍(lán)莓果汁(a)和果醬(b)的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of blueberry juice(a)and blueberry jam (b)made in Greater Khingan Mountains

藍(lán)莓酒樣中的有機(jī)酸種類與原料（果汁和果醬）基本相同，但含量有差別，奎寧酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸在發(fā)酵后的酒樣中質(zhì)量濃度均有所下降，而草酸和莽草酸的含量變化幅度都不大，乳酸和乙酸質(zhì)量濃度依然較低。對(duì)比前后兩年的發(fā)酵酒樣可以發(fā)現(xiàn)，2014年發(fā)酵樣品中各有機(jī)酸的含量普遍比2013年的樣品高，而且經(jīng)過(guò)木桶陳釀后，各組分質(zhì)量濃度變化并不明顯。

圖3 4種藍(lán)莓酒樣的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of four blueberry wine samples

表3 藍(lán)莓制品中有機(jī)酸的含量測(cè)定結(jié)果(n=3)Table 3 Determination results of organic acids in different blueberry sample(n=3)

表3結(jié)果表明，奎寧酸含量遠(yuǎn)高于蘋(píng)果酸和檸檬酸，奎寧酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸是野生篤斯藍(lán)莓制品中含量最為豐富的有機(jī)酸。

2.3 回收率實(shí)驗(yàn)

以大興安嶺藍(lán)莓果汁為基底進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，在樣品中分別加入蘋(píng)果酸、奎寧酸和檸檬酸，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后直接進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 藍(lán)莓果汁中有機(jī)酸的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Adding standard recoveries results of organic acids in blueberry juice

由表4可知，各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為82%～110%，表明本方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性較好。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用Venusil ASB C18色譜柱，建立了同時(shí)測(cè)定篤斯越桔制品中7種有機(jī)酸的定性和定量方法，該方法準(zhǔn)確可靠，實(shí)現(xiàn)了對(duì)6種藍(lán)莓制品中有機(jī)酸高效、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果表明，篤斯越桔果汁、果醬和果酒中的有機(jī)酸主要為奎寧酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸3種，其中奎寧酸含量最多，乳酸和乙酸的含量很少；在發(fā)酵后的果酒中奎寧酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸的含量均有所下降。各有機(jī)酸的加標(biāo)回收率為82%～110%，表明本方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性較好。本研究建立的方法可以為篤斯越桔產(chǎn)品中有機(jī)酸的定性定量檢測(cè)提供借鑒，對(duì)利用野生藍(lán)莓為原料開(kāi)發(fā)相關(guān)產(chǎn)品具有重要意義。

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Determination of 7 organic acids inVaccinium uliginosumproducts by HPLC

WEI Ming,GU Pan,LI Chengjie,YANG Hangyu,LIU Shuxun,ZHANG Jiayue,YAN Zhixiu,ZHANG Bolin,ZHU Baoqing*
(Beijing Key Laboratory of Forest Food Processing and Safety,Department of Food Science,School of Biological Science&Technology, Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

A HPLC method was developed to determine organic acids in 6Vaccinium uliginosumproducts.The HPLC separation was achieved on C18column(4.6 mm×250 mm,5 μm)at room temperature.The mobile phase was 96.9%ultrapure water-3%methanol-0.1%formic acid at a flow rate of 0.5 ml/min.The detection wavelength was set as 210 nm and sample size was 20 μl.Seven organic acids could be successfully separated from V.uliginosumproductsusing this method,including oxalic acid,quinic acid,malic acid,shikimic acid,lactic acid,acetic acid and citric acid.The results indicated that the main organic acid existing inV.uliginosumproducts was quinic acid,followed by citric acid and malic acid;the contents of lactic acid and acetic acid were quite low.

Vaccinium uliginosumproducts;organic acids;HPLC

O657.7

A

0254-5071（2014）11-0145-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.033

2014-09-11

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（C150101）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（BLX2012040）；北京林業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（X1310022033）

魏銘（1991-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸锱c生物技術(shù)。

*通訊作者：朱保慶（1982-），男，講師，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。