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（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心/外來動物疫病研究中心，山東青島 266032）

ELISA法檢測非洲豬瘟抗體實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

張永強(qiáng)，任偉杰，吳曉東，王筱真，李金明，王志亮

（中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心/外來動物疫病研究中心，山東青島 266032）

本文以滅活非洲豬瘟病毒為包被抗原，分析了包被濃度、酶標(biāo)二抗、顯色底物對ELISA法檢測非洲豬瘟抗體的影響，以期獲得最適反應(yīng)條件。以2個(gè)陽性血清和一個(gè)陰性血清為待檢樣品，用不同包被濃度、2種酶標(biāo)二抗和2種顯色底物進(jìn)行ELISA反應(yīng)，記錄吸光值，分析陰陽性樣品吸光值差異，優(yōu)化陰性樣品背景值，計(jì)算P/N值。結(jié)果表明，包被濃度為15μg/mL、二抗為HRP標(biāo)記蛋白A、顯色底物為OPD時(shí)，兩個(gè)陽性樣品P/N值分別為4.920和7.259，為本方法的最適反應(yīng)條件。

ELISA；非洲豬瘟抗體；試驗(yàn)驗(yàn)條件；優(yōu)化

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]。主要感染家豬、野豬和軟蜱，是唯一的節(jié)肢動物作為傳播媒介的DNA病毒[2]。家豬感染后以全身出血、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主要特征，致死率高達(dá)100%[3]。

目前，該病尚缺乏有效的疫苗，防控主要以早發(fā)現(xiàn)、早撲滅為主，因此診斷方法的建立和儲備在ASF防控中顯得尤為重要。Hutchings GH[4]等比較了用全病毒多抗血清和針對VP73蛋白的單抗進(jìn)行間接夾心ELISA檢測ASFV，顯示多抗血清的敏感性高于單抗。Vidal MI[5]等用VP73單抗建立的固相ELISA，檢測樣品VP73的敏感性為0.05mg/ mL，檢測病毒顆粒的敏感性為2.3×102PFU/mL。我國研究人員蔣正軍等[6]以桿狀病毒表達(dá)的ASFV P72蛋白為抗原研究和組裝了ASFV抗體檢測試劑盒。張鑫宇等[7]用原核表達(dá)的ASFV P54制備了膠體金試紙條，通過對ASF不同感染時(shí)期樣品檢測，顯示該試紙條在感染早期的符合率高于OIE推薦的ELISA檢測方法。

本研究以滅活的ASFV E70毒株為包被抗原，對包被濃度、酶標(biāo)二抗和顯色底物種類進(jìn)行了優(yōu)化，為后續(xù)進(jìn)行大量樣品的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和方法的標(biāo)準(zhǔn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

陽性和陰性血清由中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心保存；E70滅活病毒液由西班牙實(shí)驗(yàn)室惠贈；HRP標(biāo)記抗豬IgG、HRP標(biāo)記蛋白A、顯色液均購自SIGMA公司；ELISA板購自NUNC公司；其余為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

常規(guī)方法進(jìn)行ELISA操作。CBS（pH9.6）稀釋病毒液，37℃包被1.5h；洗滌為每次洗滌3遍；封閉為2% BSA（PBST稀釋）4℃過夜；陰陽性血清用PBST做200倍稀釋，37℃孵育1.5h；酶標(biāo)二抗用PBST進(jìn)行10000倍稀釋，37℃孵育1h；顯色時(shí)間為陰性血清孔剛出現(xiàn)顏色變化時(shí)加終止液終止。本研究對包被濃度、酶標(biāo)二抗和顯色液進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.1 包被濃度

用CBS（pH9.6）稀釋滅活A(yù)SFV，用于ELISA板的包被，設(shè)8個(gè)包被濃度，每孔加包被液100μL。

1.2.2 酶標(biāo)二抗

分別以HRP標(biāo)記抗豬IgG和HRP標(biāo)記蛋白A為酶標(biāo)二抗，進(jìn)行ELISA反應(yīng)，選擇最適酶標(biāo)二抗。

1.2.3 顯色底物

分別以四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD）為顯色液，進(jìn)行ELISA反應(yīng)，選擇最適顯色底物溶液。

2 結(jié)果

2.1 包被濃度優(yōu)化

2.1.1 試驗(yàn)1

滅活病毒原液用pH9.6 CBS分別稀釋為0.1μg/ mL，0.2μg/mL，0.4μg/mL，0.8μg/mL，1.6μg/ mL，3.2μg/mL，6.4μg/mL，12.8μg/mL，包被ELISA板。以HRP標(biāo)記抗豬IgG為二抗，TMB為顯色底物進(jìn)行ELISA反應(yīng)。結(jié)果顯示，隨著包被濃度增加，陽性血清OD值呈升高趨勢，陰性血清OD值基本未發(fā)生變化，表明增加包被抗原濃度能增加陽性血清OD值（表1）；隨著包被濃度增加，P/N值呈升高趨勢，但是均低于P/N＞2.1的判定標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。

表1 不同抗原包被濃度的陰陽性血清OD值

圖1 不同抗原包被濃度的P/N值

2.1.2 試驗(yàn)2

提高抗原包被濃度，分別以0.5μg/mL，1μg/ mL，5μg/mL，10μg/mL，15μg/mL，20μg/ mL，25μg/mL，50μg/mL的濃度包被，其它條件同上，進(jìn)行ELISA反應(yīng)。結(jié)果顯示，隨著包被濃度增加陽性樣品OD值呈升高趨勢，包被濃度≥15μg/mL時(shí)升高趨勢不明顯，陰性樣品OD值則基本無變化（表2）；隨著包被濃度增加，P/N值呈升高趨勢，包被濃度從15μg/mL開始，達(dá)到了最適濃度，20μg/mL時(shí)P/N值突然升高，應(yīng)該與N在該濃度下OD值過低有關(guān)，屬于操作誤差（圖2）。

表2 不同抗原包被濃度的陰陽性血清OD值

圖2 不同抗原包被濃度的P/N值

2.2 酶標(biāo)二抗的優(yōu)化

以HRP標(biāo)記蛋白A為酶標(biāo)二抗，其它反應(yīng)條件同2.1.2。結(jié)果顯示，HRP標(biāo)記蛋白A明顯好于HRP標(biāo)記抗豬IgG（表3）。當(dāng)抗原包被濃度≥15μg/mL時(shí)，P/N值大于2.1（圖3）。

表3 不同酶標(biāo)二抗的陰陽性血清OD值

圖3 不同酶標(biāo)二抗的P/N值比較

2.3 顯色底物溶液優(yōu)化

其它反應(yīng)條件同2.2，顯色液由TMB改為OPD進(jìn)行ELISA反應(yīng)。結(jié)果顯示，陰陽性樣品之間OD值的差異進(jìn)一步擴(kuò)大（表4）。OPD組P/N值明顯優(yōu)于TMB組（圖4）。

表4 不同顯色底物溶液的OD值

圖4 不同顯色底物溶液的P/N值比較

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過不斷優(yōu)化，最終確定了最適反應(yīng)試劑。即包被濃度為15μg/mL至50μg/mL，為了達(dá)到既能滿足實(shí)驗(yàn)要求又節(jié)省包被抗原的目的，最終確定15μg/mL為最適包被濃度；HRP標(biāo)記蛋白A為最適酶標(biāo)二抗；OPD為最佳顯色底物。

4 討論

一種血清學(xué)檢測方法的建立，需要對檢測方法的特異性、敏感性、重復(fù)性、保質(zhì)期等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)和驗(yàn)證，以及通過對大量陽性和陰性樣品的檢測來計(jì)算和確定其臨界值等，但是這些工作必須是在優(yōu)化和確立最適反應(yīng)條件后進(jìn)行。本文研究了不同包被濃度、酶標(biāo)二抗和顯色底物對以ASFV E70毒株為包被抗原檢測ASF抗體的影響，并最終確定了最優(yōu)反應(yīng)條件，為該檢測方法的后續(xù)研究和驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

以全病毒作為抗原包被ELISA板檢測待檢血清中是否存在病毒特異性抗體，特別是中和抗體，具有重要的檢測價(jià)值。由于附著在ELISA孔底部的病毒抗原成份在空間構(gòu)象、存在形式、分布和排列方式等方面與侵入機(jī)體引起免疫應(yīng)答的病毒完全相同，所以抗原和抗體間吻合度更強(qiáng)，檢測的敏感性更高。但是由于實(shí)驗(yàn)過程中需要進(jìn)行病毒培養(yǎng)和滅活，一旦操作不慎可能造成散毒，因此對實(shí)驗(yàn)條件要求比較高，特別是一些危害程度高的病原更是如此。此外，在操作過程中需要注意由于不同批次病毒液中的病毒含量可能不同，病毒液處理過程中對病毒顆粒的損壞程度有所差異，因此需要用標(biāo)準(zhǔn)品對每一批次病毒液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

本實(shí)驗(yàn)對兩種酶標(biāo)二抗比較后發(fā)現(xiàn)，HRP-蛋白A明顯優(yōu)于HRP-antiIgG，提示蛋白A更適合作為本實(shí)驗(yàn)的酶標(biāo)二抗。蛋白A是從A類鏈菌中分離出來的胞壁蛋白，能與除狗以外的多數(shù)哺乳動物的IgG Fc段結(jié)合（包括：人、山羊、綿羊、兔、豚鼠、馬、豬、猴、小鼠等），不結(jié)合人IgM、IgD、和IgA。通常以酶標(biāo)蛋白A作為二抗，敏感性高于酶標(biāo)抗抗體的敏感性，但背景值往往偏高。從本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中也可以看出，以HRP-anti-IgG為二抗時(shí)陽性血清平均OD值為0.557，陰性血清平均OD值為0.331；以HRP-Protein A為二抗時(shí)，陽性血清平均OD值為1.130，陰性血清平均OD值為0.484，HRP-Protein A的值明顯偏高。作者猜測原因可能為蛋白A分子量42kD，而IgG分子量150kD左右，因此蛋白A空間體積更小，更容易突破空間位阻與一抗結(jié)合，因此敏感性提高，同時(shí)也造成了背景值偏高的現(xiàn)象。

此外，本實(shí)驗(yàn)對兩種顯色底物溶液比較后發(fā)現(xiàn)，OPD（鄰苯二胺）明顯優(yōu)于TMB（四甲基聯(lián)苯胺）。OPD顯色時(shí)陰性平均OD值僅為0.108，而TMB顯色時(shí)陰性平均值達(dá)到0.484。兩者比較，OPD顯色對于降低背景值方面效果明顯，雖然OPD也會降低陽性樣品的OD值，但是通過兩者P/N值的比較可以看出，OPD顯色時(shí)P/N值明顯高于TMB。雖然文獻(xiàn)報(bào)道[9]，與OPD比較，TMB是一種更優(yōu)良的顯色底物，TMB在靈敏度上高于OPD 4倍以上，但就本實(shí)驗(yàn)而言，由于主要問題是背景值太高，因此選擇敏感性相對低一些的OPD更為合適。

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Optimizing the Conditions of an Indirect ELISA for Detection of African Swine Fever Virus Antibody

Zhang Yongqiang，Wu Xiaodong，Ren Weijie，Wang Xiaozhen，Li Jinming，Wang Zhiliang

（National Research Center for Exotic Animal Diseases，China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

In the study，the effects of antigen coating concentration，enzyme labeled antibody and chromogenic substrate in an ELISA with inactivated African swine fever virus as coating antigen were analyzed for detection of ASFV antibody. In order to obtain the optimum reaction conditions，different coating antigen concentrations，2 type enzymelabeled antibody and 2 type chromogenic substrates were used in the ELISA to detect 2 positive serum samples and 1 negative serum sample. The result showed that the optimum reaction conditions were：the antigen coating concentration was 15μg/mL；Protein A-HRP was used as labeled antibody，and OPD as chromogenic substrate and the P/N value of 2 positive serum samples were 4.920 and 7.259.

ELISA；African swine fever virus antibody；test condition；optimization

S858.28；S852.659.1

：A

：1005-944X（2014）11-0097-04

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201103008）

王志亮