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（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；）

三種豬病相關(guān)microRNAs的研究

柏亞鐸1，尹羿1，郭敏卓1，劉凌1，王琳麗1，汪琳1，李衛(wèi)華2

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032；）

本實(shí)驗(yàn)旨在探索繁殖與呼吸綜合征（PRRS）、口蹄疫（FMD）和傳染病胃腸炎（TGE）感染豬的microRNA （miRNA）變化，為疫病監(jiān)測(cè)提供新途徑。采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)可能的相關(guān)病毒miRNA，在MARC-145細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染10種miRNA mimic和inhibitor。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖，而敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促進(jìn)PRRSV復(fù)制；感染豬口蹄病毒的樣本中l(wèi)et-7a表達(dá)量明顯上升，而miR-146b表達(dá)量明顯下降；對(duì)照組中miR-142的表達(dá)量高于患有傳染性胃腸炎樣品。說(shuō)明相關(guān)microRNAs可能參與病毒調(diào)控，可用作檢測(cè)參考指標(biāo)。

豬繁殖與呼吸綜合征；豬口蹄疫；豬傳染病胃腸炎；microRNA；生物信息學(xué)方法

病毒感染性疾病嚴(yán)重危害動(dòng)物健康，是動(dòng)物檢疫工作的主要檢測(cè)對(duì)象[1-2]。當(dāng)前，豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱藍(lán)耳病，是一種嚴(yán)重危害我國(guó)乃至全世界養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的豬免疫抑制性疾病，尤其是高致病性藍(lán)耳病的爆發(fā)對(duì)我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失[3]。豬口蹄疫（FMDV）是國(guó)際重點(diǎn)檢疫對(duì)象，它是由口蹄疫病毒引起偶蹄動(dòng)物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，表現(xiàn)為蹄冠、趾間、蹄踵皮膚發(fā)生水泡和爛斑，部分豬口腔黏膜和鼻盤也有同樣病變[4]。豬傳染病胃腸炎（TGE）是由豬傳染病胃腸炎病毒引起的一種高度接觸性消化道傳染病，以嘔吐、水樣腹瀉和脫水為特征[5-6]。

miRNAs是一類長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸的非編碼小分子RNA，在進(jìn)化上具有高度保守性。miRNA通常以單拷貝、多拷貝或基因簇等形式存在于基因組中，首先編碼基因轉(zhuǎn)錄出初級(jí)轉(zhuǎn)錄本，在Drosha酶和Dicer酶的作用下剪切成約22個(gè)核苷酸的成熟單鏈RNA。成熟的miRNA能夠與靶標(biāo)mRNA分子的3’末端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，形成RNA沉默復(fù)合體并對(duì)靶標(biāo)基因mRNA產(chǎn)生抑制性信號(hào)，使蛋白表達(dá)受到抑制，或直接導(dǎo)致mRNA的降解，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[7-10]。本實(shí)驗(yàn)旨在尋找豬體中發(fā)揮免疫作用的miRNA，為傳染病檢測(cè)探索新的方法。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系、血清和細(xì)胞培養(yǎng)基

MARC-145細(xì)胞系、PK-15細(xì)胞系、胎牛血清購(gòu)自HyClone；高糖DMEM購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 主要試劑和儀器

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Takara Mini BEST DNA Fragment Purifcation Kit購(gòu)自寶生物工程（大連）公司。

臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5417R）；常規(guī)PCR 儀（GeneAmp PCR System 9700，ABI）；熒光PCR 檢測(cè)儀（Roche 480、ABI 7500）。

1.3 miRNA和引物合成（表1，2）

人工合成miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155 mimic及其抑制物inhibitor，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，同時(shí)合成陰性對(duì)照miRNA control及相應(yīng)抑制物inhibitor control。

表1 各種miRNA mimics和inhibitor序列

表2 Real-time PCR引物

1.4 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與FMDV、PRRSV、TGE 3’-UTR作用的潛在miRNA

生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與FMDV、PRRSV、TGE-3’-UTR作用的潛在miRNA[11]，根據(jù)miRBase公布的miRNA，結(jié)合Mirnada，RNA hybrid和RNA22三個(gè)網(wǎng)絡(luò)軟件，預(yù)測(cè)FMDV、PRRSV、TGE 3’-UTR有潛在靶標(biāo)的豬miRNA，選出可能性最大的miRNAs進(jìn)行試驗(yàn)。

1.5 提取miRNA的優(yōu)化

取50-100 mg組織（豬口蹄疫病毒收集膿皰液體，高致病性藍(lán)耳病收集豬肺組織，傳染性胃腸炎收集腸組織）放入1.5mL離心管，加入1mL Trizol混勻，加入氯仿，震蕩混勻10-15s，室溫放置2-3min，12000r/min 4℃離心15min，小心吸取上清透明液體500uL，移入一新離心管。加入等體積的異丙醇，使RNA析出沉淀。4℃離心，棄掉上清，加入1 mL 預(yù)冷的75%乙醇洗滌沉淀，溫和震蕩。4℃離心后小心棄去上清。待乙醇蒸發(fā)后取一定量（20-200uL）DEPC水，測(cè)量濃度及OD值。按組成配制反應(yīng)液體系及反應(yīng)條件（表3，4）。

表3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

表4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件

1.6 Real-time PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用7500 fast Realtime-PCR儀（ABI公司）對(duì)上述獲得的cDNA進(jìn)行檢測(cè)。并優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，發(fā)現(xiàn)普通RT-PCR在60℃3s，72℃ 11s，80℃ 3s有44個(gè)循環(huán)，miRNA RTPCR在95℃ 15s，60℃ 1min有40個(gè)循環(huán)。

表5 普通RT-PCR反應(yīng)體系

表6 普通RT-PCR反應(yīng)條件

表7 miRNA RT-PCR反應(yīng)體系

表8 miRNA RT-PCR反應(yīng)條件

2 結(jié)果

2.1 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)與FMDV、PRRSV和TGE相關(guān)的miRNA

結(jié)合Mirnada、RNAhybrid和RNA22三個(gè)靶標(biāo)預(yù)測(cè)軟件，篩選到10條與潛在的豬miRNAs， miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155，由于他們的特異性，所以對(duì)其進(jìn)一步篩選和檢測(cè)。

2.2 miRNA在豬繁殖與呼吸綜合征中的表達(dá)量差異

為了了解miRNA對(duì)PRRSV的影響，根據(jù)現(xiàn)有的研究挑選合適的miRNA，合成miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155 mimic和inhibitor。MARC-145細(xì)胞分別用mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染（濃度為30nM），12h后接著用PRRSV（WUH3株）感染細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞檢測(cè)病毒的繁殖。本研究通過(guò)噬斑實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖（圖1A）；相反，敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促進(jìn)PRRSV復(fù)制（圖1B）；其他的miRNA在MARC-145細(xì)胞中對(duì)病毒的繁殖沒(méi)有明顯的變化（圖1A和圖1B）。

圖1 miR-125b、miR-147和miR-181對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制情況

之前數(shù)據(jù)顯示噬斑實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖；相反，敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促進(jìn)PRRSV復(fù)制；其他的miRNA在MARC-145細(xì)胞中對(duì)病毒的繁殖沒(méi)有明顯的變化。這說(shuō)明他們可能參與豬繁殖與呼吸綜合征，所以進(jìn)一步探索，本實(shí)驗(yàn)收集病豬與正常豬肺組織提取miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-125b、miR-147和miR-181在感染病毒后表達(dá)量明顯下降（圖2），因此它們可能作為病毒病檢測(cè)的指標(biāo)。

圖2 熒光定量檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征中miRNA的表達(dá)量對(duì)比

2.3 miRNA在豬口蹄疫病毒中的表達(dá)量差異

圖3 let-7a和miR-146b對(duì)口蹄疫病毒復(fù)制情況

人工合成miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a和miR-146b mimic和inhibitor。PK-15細(xì)胞分別用mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染（濃度為30nM），12h后接著用FMDV（Asia1江蘇株）感染細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48h后，收集細(xì)胞檢測(cè)病毒繁殖情況。本研究通過(guò)噬斑實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)let-7b降低了FMDV的繁殖，過(guò)表達(dá)miR-146b增加了病毒繁殖（圖3A），相反，敲低let-7b能促進(jìn)FMDV復(fù)制，敲低miR-146b降低了病毒繁殖（圖3B），其他的miRNA在PK-15細(xì)胞中對(duì)病毒的繁殖沒(méi)有明顯的變化（圖3A和圖3B）。

用real-time PCR檢測(cè)感染口蹄疫病毒的豬的膿皰中提取的miRNA，根據(jù)以前相關(guān)的報(bào)道以及前期試驗(yàn)，篩選出let-7a和miR-146b，本研究對(duì)比健康組織和感染口蹄疫病毒（FMDV）豬的樣本，通過(guò)real-time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)感染病毒的樣本中l(wèi)et-7a表達(dá)量明顯上升，而miR-146b表達(dá)量明顯下降（圖4）。這就說(shuō)明let-7a和miR-146b參與了對(duì)口蹄疫病毒的調(diào)控。

圖4 熒光定量檢測(cè)豬口蹄疫病毒中miRNA的表達(dá)量對(duì)比

2.4 豬傳染性胃腸炎檢測(cè)miRNA的表達(dá)量差異

針對(duì)這10種miRNA，本實(shí)驗(yàn)主要挑選與它同源相似性高的miR-142進(jìn)行檢測(cè)，從組織中提取RNA，然后real-time PCR檢測(cè)miR-142的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組中miR-142的表達(dá)量高于患有傳染性胃腸炎樣品（圖5）。所以miR-142也可能作為一個(gè)檢測(cè)miRNA來(lái)判定是否患有傳染性胃腸炎。

3 討論

現(xiàn)有大量研究證明，細(xì)胞中miRNA可以對(duì)病毒起到調(diào)節(jié)作用[12-14]。所以miRNA與豬口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征以及豬傳染性胃腸炎的研究有助于為病毒防控帶來(lái)新的機(jī)遇[15-16]。

圖5 熒光定量檢測(cè)傳染性胃腸炎中miR-142的表達(dá)差異

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了10條豬的miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證，其數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了在MARC-145細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染miR-125、miR-24、miR-147、miR181、miR125b、let-7a、miR-146a、miR-146b、miR142、miR-155 mimic和inhibitor，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-125b、miR-147和miR-181降低了PRRSV的繁殖，而敲低miR-125b、miR-147和miR-181能促進(jìn)PRRSV復(fù)制。其他miRNA在MARC-145細(xì)胞中對(duì)病毒的繁殖沒(méi)有明顯的變化，說(shuō)明這三種miRNA對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征起調(diào)節(jié)作用。根據(jù)之前的一些報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)收集了患有豬口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征以及豬傳染性胃腸炎的樣本，在患有豬口蹄疫病毒中檢測(cè)到let-7a表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，然而miR-146b表達(dá)量卻明顯低于對(duì)照組，結(jié)果顯示了let-7a和miR-146b參與了豬口蹄疫病毒的調(diào)控。同時(shí)將正常肺組織對(duì)比了患有豬繁殖與呼吸綜合征的肺組織，發(fā)現(xiàn)miR-125b、miR-147和miR-181在感染病毒后表達(dá)量明顯下降，這與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，因此可作為該病檢測(cè)的一個(gè)靶點(diǎn)。根據(jù)生物學(xué)預(yù)測(cè)的miRNA，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了miR-142在傳染性胃腸炎樣本中表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它稍微低于對(duì)照組，說(shuō)明它也可能參與其表達(dá)。

miRNA與豬口蹄疫、豬繁殖與呼吸綜合征以及豬傳染性胃腸炎的研究不僅能檢測(cè)出進(jìn)口活豬潛在攜帶的所有病毒種類，定期對(duì)來(lái)自不同國(guó)家的豬進(jìn)行大規(guī)模疫病篩查，了解世界各國(guó)豬疫病流行情況，并在出現(xiàn)動(dòng)物死亡時(shí)，可以快速、準(zhǔn)確地篩查出死亡豬體內(nèi)可能存在的病毒，為判斷死因提供依據(jù)。

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A Preliminary Study of microRNAs Associated with Three Swine Diseases

Bai Yaduo1，Yin Yi1，Guo Minzhuo1，Liu Ling1，Wang Linli1，Wang Lin1，Li Weihua2

（1. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026；
2. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Abstrct：The study was aimed to explore the pig microRNA（miRNA）associated with porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV），foot and mouth disease virus（FMDV）of pig and transmissible gastroenteritis virus （TGEV）infections in order to explore new means for disease detection. At first，the virusassociated miRNAs were predicted by bioinformatics method. Then，MARC-145 cells were transfected with the mimic or inhibitor of various miRNAs，and the related experiments showed that over expression of miR-125b，miR-147 and miR-181 could inhibit PRRSV replication and their knockdown could promote virus replication；the let-7a expression was increased signif cantly while the miR-146b expression decreased signif cantly in FMD-infected pig samples；and the miR-142 expression in the control group was higher than in the TGE-infected samples，suggesting that associatedmiRNAs were possibly involved in virus modulation and could be used as disease indicators.

porcine reproductive and respiratory syndrome；foot and mouth disease；transmissible gastroenteritis；microRNA；bioinformatics method

S858.28

：A

：1005-944X（2014）11-0090-05

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK027）資助

柏亞鐸