鄭麗蘭，張海明，段曉冬，沈 丹，張海冰，譚 諾，楊穗娟

（廣州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣東廣州 510440）

尼帕病毒?。∟ipah virus disease）是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)由副粘病毒科亨尼病毒屬的尼帕病毒引起的人畜共患的自然疫源性疾病，尼帕病毒可以感染豬、人、犬、貓、馬、山羊、果蝠等多種動(dòng)物。其中，大蝙蝠科中的狐蝠是尼帕病毒的主要攜帶者和傳播媒介[1]。該病于1997年在馬來(lái)西亞森美蘭州Nipah村首次發(fā)現(xiàn)，1998-1999年又一次在馬來(lái)西亞的豬群中暴發(fā)，隨后在新加坡、澳大利亞、孟加拉國(guó)及印度的West Bengal地區(qū)（與中國(guó)、孟加拉國(guó)接壤）也暴發(fā)了本病，造成許多人死亡和重大的經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。泰國(guó)和柬埔寨雖然沒(méi)有暴發(fā)本病，但在這兩個(gè)國(guó)家的果蝠中檢測(cè)到了尼帕病毒的RNA[4-5]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[6]，馬來(lái)西亞于1998年9月至1999年12月期間共計(jì)有283人感染病例，其中109人死亡，病死率高達(dá)38.5%。為控制疫情，馬來(lái)西亞撲殺了116萬(wàn)余頭豬和23736只/匹其他動(dòng)物。2009年7月，世界衛(wèi)生組織公布的尼帕病毒暴發(fā)年表顯示該病毒感染已經(jīng)造成475人感染，251人死亡，各地報(bào)道的病死率為9%～100%[7-8]。由此可見(jiàn)，尼帕病毒是一種傳播速度快、危害性極強(qiáng)的極度危險(xiǎn)的病毒，已經(jīng)引起了世界許多國(guó)家及國(guó)際組織的極大關(guān)注，同時(shí)它也被列為最危險(xiǎn)的生物安全4（P-4）級(jí)病原[9-10]。

雖然我國(guó)目前還沒(méi)有尼帕病毒感染的病例報(bào)道，但是我國(guó)科學(xué)家于2004—2007年對(duì)云南等我國(guó)大陸10個(gè)省的蝙蝠進(jìn)行了尼帕病毒感染的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分蝙蝠的血清中存在尼帕或類(lèi)似尼帕病毒的抗體[11]，表明我國(guó)存在發(fā)生尼帕病毒病疫情的風(fēng)險(xiǎn)。另外，我國(guó)與已經(jīng)發(fā)現(xiàn)尼帕病毒存在的如印度等國(guó)家的地理位置接近，我國(guó)國(guó)內(nèi)又存在有該病毒的天然宿主―狐蝠[12]，隨著我國(guó)對(duì)外貿(mào)易的快速發(fā)展，尼帕病毒傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)正在加大。

廣東從化無(wú)規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)（以下簡(jiǎn)稱(chēng)從化無(wú)疫區(qū)）所在的廣東省地處熱帶亞熱帶，氣溫適宜，雨量充沛，蝙蝠種類(lèi)多，同時(shí)，豬、馬等易感動(dòng)物數(shù)量多、分布廣，一旦上述病毒傳入，將非常適合尼帕病毒的傳播和流行。而從化無(wú)疫區(qū)是我國(guó)內(nèi)地首個(gè)同時(shí)獲得國(guó)家和國(guó)際認(rèn)可的動(dòng)物疫病無(wú)疫區(qū)[13]，保持尼帕病毒病的無(wú)疫狀態(tài)是從化無(wú)疫區(qū)維護(hù)工作的重中之重。因此，為了解從化無(wú)疫區(qū)中的蝙蝠分布以及其攜帶尼帕病毒的情況，我們對(duì)從化無(wú)疫區(qū)的核心區(qū)、監(jiān)控區(qū)和緩沖區(qū)進(jìn)行了為期一年的監(jiān)測(cè)。

1 材料和方法

1.1 試劑

尼帕病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒購(gòu)自廣州維伯鑫生物科技有限公司，RNA提取試劑購(gòu)自美國(guó)應(yīng)用生物有限公司。

1.2 調(diào)查范圍

根據(jù)《廣東省從化馬屬動(dòng)物疫病區(qū)域化管理辦法》的規(guī)定，對(duì)核心區(qū)和監(jiān)控區(qū)（從化市）及緩沖區(qū)（白云區(qū)、花都區(qū)、蘿崗區(qū)、清城區(qū)、增城市、龍門(mén)縣、佛岡縣、新豐縣）進(jìn)行調(diào)查。

1.3 調(diào)查點(diǎn)選擇

現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查共設(shè)置14個(gè)調(diào)查采樣點(diǎn)。其中，從化市內(nèi)設(shè)4個(gè)調(diào)查點(diǎn)，緩沖區(qū)的8個(gè)區(qū)縣共設(shè)10個(gè)調(diào)查點(diǎn)，平均分布在8個(gè)區(qū)縣內(nèi)。依據(jù)蝙蝠的生活習(xí)性，采樣點(diǎn)多設(shè)在具有果園、田野、棕櫚樹(shù)、山洞和廢棄老房子等地方。

1.4 調(diào)查時(shí)間的選擇

對(duì)各個(gè)采樣點(diǎn)分別在4個(gè)季節(jié)進(jìn)行調(diào)查采樣，見(jiàn)下表1。

表1 調(diào)查日期信息表

1.5 蝙蝠調(diào)查方法

根據(jù)不同的調(diào)查環(huán)境選取不同的捕捉方法。本次蝙蝠調(diào)查采用聲頻調(diào)查結(jié)合粘網(wǎng)捕捉和手抄網(wǎng)捕捉方法。在可能存在蝙蝠的棕櫚樹(shù)、山洞以及廢棄的老屋子等環(huán)境中，先用超聲波探測(cè)儀 UltraSound detector D230 （ Petters-son Elektronik AB）監(jiān)聽(tīng)是否有蝙蝠超聲波回聲定位信號(hào)，初步判斷此處是否有蝙蝠存在，然后選取霧網(wǎng)（6M×3M）和鳥(niǎo)網(wǎng)（15M×4M）或是手抄網(wǎng)進(jìn)行捕捉，當(dāng)蝙蝠撞網(wǎng)后小心將其解下，將蝙蝠裝入干凈小布袋，每袋一只，編號(hào)標(biāo)記帶回駐地采樣蝙蝠的咽/肛棉拭子，放入到盛有約1mL的PBS緩沖液的Corning內(nèi)旋凍存管中，用剪刀將棉簽頭剪斷，保留在管中。同一動(dòng)物個(gè)體的咽拭子頭和肛拭子頭放入同一個(gè)凍存管中，并按照唯一性編號(hào)原則進(jìn)行編號(hào)后放入到液氮罐中保存送檢。

1.6 蝙蝠調(diào)查強(qiáng)度

本次調(diào)查共設(shè)網(wǎng)57張次，有效調(diào)查時(shí)間2564小時(shí)，平均每個(gè)季節(jié)布設(shè)調(diào)查網(wǎng)次約14.3±9張次，平均有效調(diào)查時(shí)間約641.3±385.9小時(shí)。

1.7 核酸提取

按照美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司RNA/DNA磁珠提純?cè)噭┱f(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作：于試劑板樣品孔中分別加入50μL經(jīng)充分振蕩混懸的樣品液體、130μL裂解液和20μL磁珠Enhancer混合液，再將所有試劑板置于Kingfisher Flex磁珠分選純化儀進(jìn)行核酸提取。

1.8 尼帕病毒核酸PCR檢測(cè)

采用廣州維伯鑫生物技術(shù)有限公司的尼帕病毒熒光定量試劑盒。反應(yīng)總體積25μL，包括PCR混合液20μL，Taq DNA酶1μL，反轉(zhuǎn)錄酶1μL，模板3μL。反應(yīng)條件：42℃ 20min，94℃2min一個(gè)循環(huán)；94℃ 30s，55℃ 45s，40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 蝙蝠的種類(lèi)和數(shù)量

在14個(gè)調(diào)查點(diǎn)中，有12個(gè)調(diào)查點(diǎn)記錄有蝙蝠，在從化良口鎮(zhèn)流溪河林場(chǎng)和龍門(mén)縣地派鎮(zhèn)羅峒村兩個(gè)點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)蝙蝠。因此，下述分析數(shù)據(jù)基于12個(gè)有蝙蝠記錄調(diào)查點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行。調(diào)查共采樣蝙蝠241只，隸屬于3科4屬11種，其中夏季捕獲蝙蝠2只1種，秋季捕獲蝙蝠53只8種，冬季調(diào)查捕獲蝙蝠116只5種，春季捕獲蝙蝠70只6種。

對(duì)所調(diào)查的蝙蝠的科屬、物種和個(gè)體數(shù)量、分布情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，菊頭蝠科有74只，隸屬于1屬6種，是物種組成中的優(yōu)勢(shì)科。蹄蝠科有164只，隸屬于1屬3種，該科在種群數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)，具體如表2所示。

表2 采樣蝙蝠的屬、種和個(gè)體數(shù)比例信息表

2.2 各調(diào)查位點(diǎn)蝙蝠物種、種群密度分布情況

根據(jù)各調(diào)查點(diǎn)的捕獲物種數(shù)據(jù)，在GIS數(shù)據(jù)庫(kù)中使用Probability Kriging法進(jìn)行差值分析，建立物種、種群密度分布模型，如圖1、2。結(jié)果顯示，在核心區(qū)范圍內(nèi)蝙蝠物種多樣性較高，且也是種群密度較高的區(qū)域。分布在從化市東西兩側(cè)的緩沖區(qū)的蝙蝠的物種多樣性和種群密度較核心區(qū)低。

圖1 調(diào)查點(diǎn)蝙蝠物種密度分布模式圖

圖2 調(diào)查點(diǎn)蝙蝠數(shù)量密度分布模式圖

2.3 各調(diào)查點(diǎn)蝙蝠的聚集度、密度

統(tǒng)計(jì)所記錄的蝙蝠物種及其種群密度分布（圖3），發(fā)現(xiàn)種群數(shù)量在10只以下（包括10只）的物種數(shù)占總物種數(shù)的72.7%，種群數(shù)量在20只以上的僅限于小菊頭蝠、小蹄蝠、中蹄蝠3種，只占總物種數(shù)的27.3%。結(jié)果顯示在調(diào)查區(qū)域內(nèi)蝙蝠種群數(shù)量并不太高，大部分蝙蝠種群數(shù)量都在10只以下，蝙蝠密度較低。

圖3 蝙蝠不同數(shù)量范圍種數(shù)所占比例

對(duì)于種群密度大于20的小菊頭蝠、小蹄蝠、中蹄蝠3種蝙蝠，分別統(tǒng)計(jì)在各調(diào)查點(diǎn)的種群數(shù)量（圖4）。這3種物種在各調(diào)查點(diǎn)平均記錄的個(gè)體數(shù)量都在10個(gè)以下，未發(fā)現(xiàn)某個(gè)調(diào)查點(diǎn)記錄個(gè)體數(shù)量異常多，調(diào)查的蝙蝠未發(fā)現(xiàn)有明顯的集群現(xiàn)象。

圖4 3種蝙蝠平均記錄個(gè)體數(shù)分布圖

2.4 各調(diào)查位點(diǎn)蝙蝠相似性

對(duì)各調(diào)查位點(diǎn)捕獲的蝙蝠物種進(jìn)行相似性分析，運(yùn)用R軟件平臺(tái)選用ward法、manhattan距離進(jìn)行分層聚類(lèi)，并將聚類(lèi)結(jié)果放入GIS數(shù)據(jù)庫(kù)中（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)從化市鰲頭鎮(zhèn)丁坑村、白云區(qū)鐘落潭鎮(zhèn)華坑村和增城市正果鎮(zhèn)池田村的物種相似性較高，劃分為同一類(lèi)別I，該類(lèi)別主要分布在緩沖區(qū)內(nèi)，有1個(gè)點(diǎn)在監(jiān)控區(qū)內(nèi)；從化市良口鎮(zhèn)高沙村、從化市良口鎮(zhèn)糖料村、花都區(qū)花東鎮(zhèn)象山村、蘿崗區(qū)九龍鎮(zhèn)佛朗村、佛岡縣湯塘鎮(zhèn)新村、龍門(mén)縣平陵鎮(zhèn)聶屋村、鹿頸村和新豐縣梅坑鎮(zhèn)徐坑村的物種相似性較高，劃分為同一類(lèi)別II，該類(lèi)別分布在核心區(qū)和緩沖區(qū)內(nèi)，在監(jiān)測(cè)過(guò)程中需要關(guān)注的類(lèi)群之一；清城區(qū)高橋鎮(zhèn)大龍管理區(qū)和韶新豐縣縣城城頭的物種相似性較高，劃分為同一類(lèi)別III，該類(lèi)別主要在緩沖區(qū)內(nèi)。

圖 5 各采樣位點(diǎn)蝙蝠物種聚類(lèi)分析圖

2.5 尼帕病毒檢測(cè)結(jié)果

2012年7—8月、10—11月和2013年1—2月、4—5月，分別對(duì)從化市及白云區(qū)、花都區(qū)、蘿崗區(qū)、清城區(qū)、增城市、龍門(mén)縣、佛岡縣和新豐縣所采集的241只蝙蝠咽/肛棉拭子進(jìn)行了尼帕病毒的檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。

3 討論

蝙蝠屬于哺乳動(dòng)物，其物種豐富，分布廣泛，飛行能力強(qiáng)，其中大型蝙蝠還具有遷飛的習(xí)性。其棲息類(lèi)型主要分為洞棲型和樹(shù)棲型。蝙蝠是許多病毒的自然宿主，已在蝙蝠體內(nèi)分離鑒定到80多種病毒[14-16]，其中一些還是重大的人獸共患性疾病病毒，比如亨德拉病毒、尼帕病毒以及SARS病毒[17-19]。中外科學(xué)家通過(guò)對(duì)蝙蝠攜帶病毒的研究認(rèn)為：蝙蝠的飛翔特性、品種、食性、分布、棲息地的多樣性、種群的規(guī)模性以及其對(duì)自然界較強(qiáng)的適應(yīng)力，使得很多病毒容易在蝙蝠群體中生存、繁殖、進(jìn)化和傳播。我國(guó)研究人員研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)蝙蝠攜帶病毒具有普遍性，有必要開(kāi)展對(duì)蝙蝠攜帶病原的病原生態(tài)調(diào)查，以便掌握我國(guó)蝙蝠種群攜帶病毒的情況，了解病毒在蝙蝠種群中的傳播過(guò)程[20]。

本次調(diào)查記錄的到蝙蝠屬于小蝙蝠亞目的食蟲(chóng)蝙蝠，以捕食農(nóng)林害蟲(chóng)為主，未發(fā)現(xiàn)尼帕病毒的自然宿主狐蝠[21-23]。但調(diào)查發(fā)現(xiàn)，雖然該地區(qū)集群性不明顯，種群密度較低且平均，僅在一些山洞內(nèi)會(huì)形成一些集群生活的種群，但蝙蝠數(shù)量和種類(lèi)均較多。另外，通過(guò)對(duì)從化無(wú)疫區(qū)蝙蝠的相似性分析發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域的蝙蝠按相似性歸類(lèi)可分三大類(lèi)別，這三大類(lèi)種群在空間上的分布交錯(cuò)明顯，這就提示我們，蝙蝠不同物種之間接觸幾率較大，疫病的傳播幾率也較大。根據(jù)吳毅等2006年的報(bào)道，廣州市存有大蝙蝠亞目狐蝠科的棕果蝠、犬蝠等[24]，而大蝙蝠棲息于樹(shù)上或洞中，可以長(zhǎng)距離的飛行，活動(dòng)范圍廣[25]，雖然本次調(diào)查未發(fā)現(xiàn)上述蝙蝠的種類(lèi)，但也不能排除從化無(wú)疫區(qū)存在棕果蝠、犬蝠等大型蝙蝠的可能。

結(jié)合本次調(diào)查采樣的蝙蝠樣品中尼帕病毒檢測(cè)均為陰性的結(jié)果，我們認(rèn)為從化無(wú)疫區(qū)雖然存在尼帕病毒隨蝙蝠傳播進(jìn)入的風(fēng)險(xiǎn)，但風(fēng)險(xiǎn)較低，與彭聰?shù)萚13]研究結(jié)論基本一致。但是，由于本地區(qū)有較多數(shù)量和種類(lèi)的蝙蝠，存在尼帕病毒引入以及引入后傳播的條件。為保證廣東從化無(wú)規(guī)定馬屬動(dòng)物疫病區(qū)的尼帕病毒病的無(wú)疫狀態(tài)和降低本地區(qū)發(fā)生尼帕病毒病的風(fēng)險(xiǎn)，建議繼續(xù)加強(qiáng)蝙蝠等野生動(dòng)物的調(diào)查和監(jiān)測(cè)。

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