施 維，許 波，金仁桃，吳麗敏，周桂香，劉雨生，童先宏

暗色透明帶卵母細胞臨床結局及超微結構分析

施 維，許 波，金仁桃，吳麗敏，周桂香，劉雨生，童先宏

目的對暗色透明帶（ZP）卵母細胞在體外受精胚胎移植中，胚胎發(fā)育潛能及受精率、種植率、臨床妊娠率及超微結構進行分析。方法根據(jù)光鏡下ZP的折光性，將33例患者卵母細胞全部為暗色ZP的納入研究組，將108例患者卵母細胞全部為正常ZP的納入對照組。對兩組患者的年齡、不孕年限、基礎卵泡刺激素值（FSH）、促性腺激素（Gn）總量、人絨毛促性腺激素（HCG）注射日內膜厚度、HCG注射日雌二醇（E2）值、獲卵數(shù)、成熟卵率、受精率、種植率、臨床妊娠率和流產(chǎn)率進行比較分析。并對暗色ZP的卵母細胞和正常卵母細胞在透射電子顯微鏡下觀察的卵母細胞ZP、卵母細胞卵周隙、卵母細胞細胞器等超微結構進行分析。結果兩組患者年齡、不孕年限、基礎FSH、Gn總量、HCG注射日內膜厚度、HCG注射日E2值、獲卵數(shù)、成熟卵率、卵裂率和流產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學意義。而研究組的受精率、優(yōu)質胚胎率、種植率、臨床妊娠率較對照組均顯著下降（P＜0.05）。對研究組的超微結構分析發(fā)現(xiàn)，暗色ZP卵母細胞ZP內高電子致密物明顯增多，同時卵母細胞胞質中異常線粒體和液泡明顯增多。結論暗色ZP卵母細胞的超微結構改變如胞質內異常線粒體及液泡增多，從而導致卵母細胞質量下降、胚胎發(fā)育潛能和臨床妊娠結局降低。

透明帶；卵母細胞；胚胎發(fā)育；透射電鏡；線粒體

受精是一個精卵相互作用極其精細而又協(xié)調發(fā)育的復雜過程，而人類卵子受精過程中透明帶（zona pellucid，ZP）起著不可替代的作用。暗色ZP屬于胞質外異常［1－2］，曾有多個中心對暗色ZP進行了報道和相關分析，根據(jù)筆者中心臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計暗色ZP的卵母細胞在接受體外受精胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）的患者中總體發(fā)生率約為5%，筆者發(fā)現(xiàn)在一次超排卵過程中卵母細胞全部為暗色ZP的周期中受精率和胚胎發(fā)育潛能低下。因此，該研究對1次周期中出現(xiàn)全部為暗色ZP的卵母細胞進行回顧性分析及超微結構研究，探討其是否影響妊娠結局和胚胎發(fā)育潛能。

1 材料與方法

1.1 研究對象收集我院2010年11月～2012年6月共141例接受IVF或卵胞質內單精子注射技術（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）治療的不孕癥患者，其中1次促排周期中全部卵母細胞為暗色ZP的患者33例（19例IVF，14例ICSI周期）為研究組，全部卵母細胞為正常ZP的患者108例（64例IVF，44例ICSI周期）為對照組。兩組患者的年齡均≤36歲，不孕原因均為輸卵管因素、男方因素（弱精子癥、梗阻性無精子癥等）等，并排除染色體異常、卵巢低反應等疾病。收集IVF-ET周期新鮮廢棄卵母細胞（常規(guī)IVF 42～48h后未分裂的成熟受精卵母細胞）共23枚，其中暗色ZP的卵細胞11枚，正常ZP卵母細胞12枚，制作成電鏡標本觀察。所有用于研究的卵母細胞均經(jīng)患者同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方法 患者均為標準長方案：從月經(jīng)的黃體中期開始使用促性腺激素釋放激素激動劑（gonadotropin releasinghormone agonist，GnRHa）皮下注射，降調節(jié)14 d后，超聲檢查子宮內膜厚度，竇卵泡數(shù)量和大??；待血清卵泡刺激素值（folliclestimulatinghormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizinghormone，LH）、雌二醇（Estradiol，E2）達到降調標準后，則開始使用FSH和（或）尿促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG）超排卵治療。用陰道B超每天監(jiān)測卵泡發(fā)育情況，當B超顯示2個卵泡＞18 mm或3個卵泡＞17 mm時，當天肌注人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG）10 000 IU，34～36h后取卵。取卵后常規(guī)短時受精或ICSI培養(yǎng)［3］。

1.2.2 IVF-ET及妊娠結局判斷 卵母細胞取出體外后，精液處理采用上游法或密度梯度離心法。卵丘復合體培養(yǎng)4h后，根據(jù)男方精液常規(guī)指標分析指標采用不同的授精方式［4］，即（a＋b）級精子總數(shù)≥10×106的采用IVF，另外（a＋b）級精子總數(shù)＜10 ×106的采用ICSI。授精后16～18h觀察原核情況，授精42h后觀察卵裂情況，根據(jù)卵裂球大小均勻與否及碎片占整個胚胎的比例進行胚胎質量評分，將胚胎分為4級，Ⅰ級：卵裂球大小均勻，無碎片；Ⅱ級：卵裂球大小均勻，碎片＜20%；Ⅲ級卵裂球大小不均勻，碎片＜20%；Ⅳ級：卵裂球大小均勻或不均勻，碎片20%～50%。Ⅰ～Ⅱ級胚胎視為優(yōu)質胚胎，根據(jù)患者情況將2～3個形態(tài)學評分最佳的胚胎在超聲指導下移植入子宮，剩余有發(fā)育潛能的胚胎行冷凍保存。胚胎移植后第2天開始行黃體支持治療。胚胎移植14 d后檢查血清絨毛膜促性腺激素（β-HCG），陽性者繼續(xù)進行黃體支持，胚胎移植4周后B超檢查見孕囊及胚芽診斷為臨床妊娠，否則為生化妊娠。

1.2.3 光鏡下觀察ZP 將顆粒細胞去除干凈在光鏡下觀察卵母細胞ZP情況，1個超排周期中全部為暗色ZP的為研究組，正常ZP為對照組。在ICSI周期中，將顆粒細細胞包裹的卵母細胞放入FALCON 3001皿中，用40 IU透明質酸酶消化，在用手工拉細的玻璃針吹吸去除多余的放射冠細胞和血細胞，徹底將放射冠細胞和卵母細胞分離。在IVF周期中，將受精后16～18h的卵丘復合物用手工拉細的玻璃針小心吹吸多次，分離放射冠細胞和卵母細胞。將分離后的卵母細胞在奧林巴斯倒置顯微鏡下放大400倍觀察ZP情況。

1.2.4 IVF相關結局指標計算方法 ICSI周期中成熟卵率＝成熟卵數(shù)/獲卵數(shù)；IVF受精率＝受精卵數(shù)/獲得卵數(shù)×100%；ICSI受精率＝受精卵數(shù)/成熟卵數(shù)×100%；卵裂率＝卵裂卵數(shù)/受精卵數(shù)× 100%；優(yōu)質胚胎率＝（Ⅰ級胚胎數(shù)＋Ⅱ級胚胎數(shù)）/總胚胎數(shù)×100%；胚胎種植率＝妊娠囊數(shù)/移植胚胎個數(shù)；臨床妊娠率＝臨床妊娠數(shù)/移植周期數(shù)× 100%；流產(chǎn)率＝流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)×100%。

1.2.5 透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）下觀察卵母細胞 將標本迅速固定于4℃、25 g/L的戊二醛，固定4～6h后將卵母細胞從戊二醛中取出，用pH 7.2的PBS液沖洗干凈，固定于1%鋨酸1.0～1.5h，然后用梯度乙醇脫水，脫水后吸去乙醇，加入環(huán)氧丙烷透明30 min，然后換成環(huán)氧丙烷與Epon812環(huán)氧樹脂（1∶1）配制的混合液浸透1.5h，用圓錐底的塑料包埋模，最后用Epon812環(huán)氧樹脂加滿進行包埋，投入65℃烤箱中48h，降至室溫。取出包埋好的組織以60～80 nm厚度進行超薄切片（超薄切片機型號LKB-NOVA型，瑞典產(chǎn)）。將干燥好的帶樣品的銅網(wǎng)放入醋酸雙氧鈾液滴中染色30 min，用雙蒸水沖洗，再放入檸檬酸鉛液滴中染色10 min，雙蒸水沖洗后干燥，制備好的電鏡樣品JEM-1230型TEM觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，兩組獨立樣本比較采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 光鏡下觀察暗色ZP卵母細胞與正常ZP卵母細胞兩組的卵母細胞在光鏡下的形態(tài)如圖1所示，研究組為暗色ZP的卵母細胞，對照組為正常ZP的卵母細胞在光鏡下顯示出折光率不同。

圖1 光鏡下的暗色ZP卵母細胞與正常ZP卵母細胞 ×400

2.2 兩組患者一般情況及超排卵觀察指標及臨床結局比較兩組患者的年齡、不孕年限、基礎FSH、促性腺激素（Gn）總量、注射HCG日內膜厚度及E2值和獲卵數(shù)相比較，差異均無統(tǒng)計學意義，見表1。兩組在ICSI周期中成熟卵率、卵裂率間和流產(chǎn)率差異均無統(tǒng)計學意義；而研究組雙原核（two pronuclei，2PN）受精率、優(yōu)質胚胎率、胚胎種植率和臨床妊娠率均明顯低于對照組（P＜0.05），見表2。

2.3 TEM下暗色ZP卵母細胞與正常ZP卵母細胞的超微結構

表1 一般臨床資料及基本特征比較（±s）

表1 一般臨床資料及基本特征比較（±s）

項目研究組（n＝33）對照組（n＝108）t值P值年齡（歲）31.26±4.2330.56±4.390.580.56不孕年限（年）5.13±2.854.88±3.050.440.66基礎FSH（U/L）7.70±2.557.35±2.640.650.52 Gn總量（IU）2 496.63±755.862 407.53±867.140.520.61 HCG日內膜厚度（mm）11.21±2.3511.13±2.140.640.52 HCG日E2（ng/L）2 772.33±1 302.112 912.18±1 384.940.800.43獲卵數(shù)（個）10.18±5.1110.73±4.760.660.51

表2 IVF結局相關指標比較（%）

2.3.1 對照組 ZP為正常的網(wǎng)狀疏松狀結構，厚10～14 nm，含有大量卵泡細胞胞膜殘留物，內可見散在排列的纖維物，纖維呈直線型或彎曲型，長0.1～0.4 μm，見圖2A、C。對照組在卵膜和ZP之間為卵周隙，呈一狹窄透亮間隙，內可見第一極體、呈樹突狀粗大的微絨毛，見圖3C。卵膜下可見一層散在線性排列的皮質顆粒（cortical granule，CG），見圖3A。胞質內細胞器豐富，可見高爾基體及周圍的分泌小泡、光面內質網(wǎng)（smooth endoplasmic reticulum，SER）、SER集合管、SER大泡及小泡、線粒體等，其中線粒體又是最主要的細胞器。線粒體大多呈橢圓形，中度密集，有少量嵴，結構清晰；有些線粒體較平，呈新月型圍繞在SER小泡周圍；有些線粒體成簇，圍繞于整齊的SER嵴周圍，線粒體與SER小管及小泡一起，形成體積較大線粒體SER－線粒體復合物，見圖4A。

2.3.2 研究組 ZP呈網(wǎng)狀疏松結構，但可見高電子密度的致密纖維組織，明顯比正常ZP增多，見圖2B、D。卵周隙正常同對照組，可見第一極體及豐富的微絨毛等，見圖3D。卵膜下均可見散在分布的皮質顆粒，見圖3B。胞質中可見大量細胞器，高爾基體、SER、SER集合管等與對照組相比未見異常。但胞質內主要的細胞器為線粒體，其數(shù)量略減少，有的孤立存在，未與SER泡相連；線粒體結構也存在異常，如嵴結構消失或減少、形態(tài)幼稚化、內膜結構丟失、線粒體內可見空泡及膨大等，見圖4B、C。SER－線粒體復合物中也可見大量結構異常的線粒體及線粒體空泡復合物。胞質中還含大量SER液泡，打斷正常胞質間連接，見圖4D。

圖2 暗色ZP與正常ZP在TEM下的結構

圖3 TEM下兩組卵母細胞胞質與卵周隙的超微結構

3 討論

目前在IVF實驗室工作中評價卵母細胞及胚胎質量仍多采用形態(tài)學評分法，其沒有損害其生物活性及發(fā)育潛能，故很適用于輔助生殖等生物技術領域，ZP也是評價胚胎和卵母細胞質量和發(fā)育潛能的指標之一。已有研究［1，5］報道，ZP異常均可以影響受精、胚胎發(fā)育潛能和種植率。Nottola用相差顯微鏡觀察顏色發(fā)暗的囊胚，發(fā)現(xiàn)其ZP外型不規(guī)則、結構斷裂，發(fā)育潛能低下［6］；相反有學者認為暗色ZP和正常卵母細胞相比有著同樣的受精率和胚胎發(fā)育潛能，可以成功懷孕［1，7］。本研究顯示，雖然移植了暗色ZP的胚胎的患者可以成功懷孕，但臨床妊娠率顯著降低。因此筆者推測暗色ZP卵母細胞的卵母細胞質量和胚胎發(fā)育的潛能降低。

圖4 TEM下兩組的卵母細胞胞質與線粒體的超微結構

目前，TEM可作為評價卵子及胚胎質量的最有價值的客觀評判標準。本研究發(fā)現(xiàn)暗色ZP卵子的ZP內高電子致密物及纖維物明顯增多，這有可能是ZP在光鏡下折射改變的原因之一。ZP是由初級卵母細胞分泌而形成的酸性糖蛋白膜，在誘導精卵識別和結合，激活精子發(fā)生頂體反應，受精后阻止多精入卵中起著重要的作用［8］。任何ZP結構、蛋白成分發(fā)生異常都會影響精、卵正常結合，導致受精失敗，而且ZP蛋白質表達減少或者修飾異?？赡苤苯臃磻雎涯讣毎墒爝^程中存在的不足［9］，同時也表明顆粒細胞和卵母細胞胞質之間正常的信號通信和連接可能受到了干擾。本研究發(fā)現(xiàn)暗色ZP的卵子在IVF和ICSI周期中的受精率均明顯降低，表明暗色ZP并不是通過阻止精卵結合來影響正常的受精過程，而是表明這些暗色ZP的卵子可能成熟程度不足，并且與周圍顆粒細胞的通訊存在障礙。

其次，本研究用TEM觀察時發(fā)現(xiàn)，暗色ZP的卵母細胞胞質內線粒體結構嚴重畸形，線粒體空泡、膨大、內膜結構丟失等。線粒體作為卵母細胞內最主要的細胞器，產(chǎn)生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），是細胞的主要能量供應者，對卵母細胞發(fā)育潛能起著決定性作用，與細胞的代謝水平、增殖和分化密切相關［10－11］。線粒體形態(tài)結構的改變可以直接影響代謝活動，從而降低卵母細胞的質量和胚胎發(fā)育潛能［12］。異常線粒體的數(shù)量在胞質中明顯增多，可能影響了卵母細胞的正常能量代謝和提供，從而導致暗色ZP卵母細胞受精能力及優(yōu)質胚胎率的下降。

暗色ZP卵母細胞的胞質中發(fā)現(xiàn)有大量液泡結構打斷了胞質中正常連接。研究［13］顯示卵母細胞液泡的形成可能也標志著其他胞質超微結構的改變，如受損的線粒體的存在、卵黃膜斷裂等卵母細胞凋亡、衰老方面的表現(xiàn)。Coticchio et al［14］指出在發(fā)育成熟卵母細胞中很少出現(xiàn)，這些液泡可能被認為是胞質不成熟的一個標志。

研究組中IVF和ICSI受精率、優(yōu)質胚胎率、種植率和臨床妊娠率與對照組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義。根據(jù)TEM研究結果表明，這些卵子胞質可能不成熟，胞質與核發(fā)育不同步，影響了卵母細胞的正常發(fā)育，從而導致受精失敗，發(fā)育潛能低下。另外，研究組的卵母細胞可能存在著卵子本身質量低下，影響了卵母細胞正常的生長發(fā)育，致使優(yōu)質胚胎率下降。即使種植了優(yōu)質的胚胎由于胚胎內部線粒體異常能量代謝不協(xié)調，胚胎發(fā)育異?；蜃铚鴮е路N植率下降，臨床妊娠結局差的結果。

本研究即應用TEM觀察暗色ZP卵母細胞的超微結構，結合線粒體及其他細胞器形態(tài)特征與功能的改變，分析卵母細胞受精失敗及胚胎發(fā)育阻滯的原因。發(fā)現(xiàn)其超微結構的改變可能是造成其臨床妊娠結局下降的重要原因，所以暗色ZP可能提示了胚胎發(fā)育潛能較差，在選擇移植胚胎時應避免選擇暗色ZP的胚胎。

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Analysis of the clinical outcome and ultrastructure of the oocytes with dark zona pellucida

Shi Wei，Xu Bo，Jin Rentao，et al
（Center for Reproductive Medicine，The Affiliated Provincial Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230001）

ObjectiveTo analyze the embryo developmental potential，fertilization rate，implantation rate，clinical pregnancy rate and ultrastructural of oocytes with dark zona pellucid（DZP）in vitro fertilization-embryo transfer.MethodsAccording to the different refraction of zona in microscope，the oocytes with DZP retrieved from 33 patients were collected as the study group，and 108 patients of whom oocytes with normal zona pellucida were received as controls.The age，duration of infertility，basic FSH，total of Gn doses，endometrial thickness on HCG day，E2 value on HCG day，number of oocytes，MII oocytes rate，fertilization rate，good embryos rate，implantation rate，clinical pregnancy rate and abortion rate were compared respectively between these two groups.The ultrastructure of oocytes with DZP and normal zona pellucida was detected using transmission electron microscope，including zona pellucida，perivitelline space，oocyte organelles.ResultsNo differences were detected in the age，duration of infertility，basic FSH，total of Gn doses，endometrial thickness on HCG day，E2 value on HCG Day，number of retrieving oocytes，rate of MII oocytes and abortion rate between them.The rate of fertilization in IVF and ICSI cycles，good embryos，implantation and clinical pregnancy in study group were significantly lower than that in control group.By ultrastructural analysis of using transmission electron microscopy（TEM），the appearance ofhigh electron dense in DZP，the number of abnormal mitochondria and vacuoles in the cytoplasm of oocytes with DZP increased significantly.ConclusionThe ultrastructural alterations such as abnormal mitochondria and intracytoplasmic vacuoles in oocytes with DZP，are resulting in reduced oocytes quality，embryo development potential and poor clinical pregnancy outcome.

zona pellucida；oocytes；embryo development；TEM；mitochondria

R 321-33

A

1000－1492（2014）04－0434－05

2013－10－16接收

國家自然科學基金（編號：81373671）；安徽省自然科學基金（編號：1308085QH131）；安徽省教育廳自然科學基金（編號：KJ2013Z134）

安徽醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，合肥 230001

施 維，女，碩士研究生；劉雨生，男，教授，主任醫(yī)師，博士生導師，責任作者，E-mail：shizhizhongxin＠126.com；童先宏，男，副主任醫(yī)師，碩士生導師，責任作者，E-mail：tong68xianhong＠163.com